凍結ヒトiPS細胞の解凍の手順

ＪＣＲＢ細胞バンク：古江-楠田美保

２００９．４．２．

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準備するもの
解凍準備
1. 25cm²フラスコに0.1%ゼラチン溶液を3mlずつ入れる.
2. 37℃インキュベーターに３０分静置　（室温の場合、２時間以上）.
3. MEF用培地を作成^（注3）.
4. ゼラチン液を吸引.PBSにて洗浄.各フラスコにMEF用培地を4mlずつ入れる.
5. 15mlチューブにMEF培地を9ml入れる．
6. 液体窒素に入れたまま凍結MEFバイアルをクリーンベンチ近くに持ってくる．
7. バイアルの蓋をクリーンベンチ内で開けてバイアルのN₂を抜く.
8. 37℃ウォーターバスに入れ、半分ぐらい溶解状態でクリーンベンチ内へ移動し、MEF培地でピペッティングしながらすばやく溶解．
9. MEF浮遊液を15mlチューブに入れる．
10. 1000rpm で３分間遠心
11. 新しいMEF用培地にMEFを浮遊させる.
12. MEF細胞浮遊液を1mlずつ各フラスコに入れる．
13. MEFをCO₂インキュベーターに入れて、２４時間培養．
14. MEF用培地からES用培地(FGF-2なし)に交換し、２４時間培養^（注4）．
細胞解凍
1. ヒトiPS用培地16mlを50ml用遠心管に分取する。
2. そのうち、ヒトiPS用培地9mlを15ml用遠心管に入れ、37℃ウォーターバスで暖めておく．
3. 残りの7mlヒトiPS用培地にFGF-2 (10ng/ml)を添加して、クリーンベンチ内に置く．
4. 液体窒素に入れたまま凍結ヒトiPS細胞のバイアルをクリーンベンチ近くに持ってくる．
5. 37℃ウォーターバスで暖めてある15ml用遠心管に入ったヒトiPS用培地をクリーンベンチに持ってくる．
6. ピンセットで凍結バイアルを液体窒素から取り出し、クリーンベンチ内に入れて蓋を開け、暖かい培地を入れてピペッティングを行って、素早く解凍させる．
7. 解凍させた細胞をすばやく15ml用遠心管に回収する．
8. 700rpm (90xg)にて遠心する．
9. MEF浮遊液を15mlチューブに入れる．
10. 上清を吸引.
11. FGF-2の入ったヒトiPS用培地7mlを加える．
12. MEFが播種してあるフラスコの培地を吸引．
13. ヒトiPS細胞浮遊液7mlをフラスコ１つに播種．
14. 顕微鏡でコロニーの分散状態を確認．
15. CO₂インキュベーターに入れて培養（２４時間）．
16. 細胞観察（できるだけ揺らさないようにする）^（注5）.
17. CO₂インキュベーターに入れて培養（２４時間）．
培地交換
1. 培地交換に必要なヒトiPS用培地をチューブに分取し、FGF-2を入れる．
2. 37℃ウォーターバスで培地を温める^（注6）．
3. 細胞の状態を顕微鏡でチェック．
4. 温めた培地を取り出す．
5. フラスコの培地を吸引．
6. 温めた培地を入れる．
7. 細胞の状態をチェック．
8. CO²インキュベーターに入れて、培養．
9. 基本的に毎日培地交換を行う^（注7）．

注

メーカーによって細胞の生着率や継代時のディスパーゼの処理時間なども変わってくる．BD、スミロンは、Corningとほぼ同等．
成育医療センター樹立iPS細胞は、C57/BL6マウスのMEFを使用して樹立されている．市販のものでは、マイトマイシンC処理済みHygro Resistant Strain C57/BL6（ミリポア）が使用可能であることを確認している．MEFバイアル１本を30枚の25cm²フラスコに播種している．ただし、ロット差があるため、新しいロットの際には、密度を変えて播種してチェックする必要がある．
high glucose, L-gluthamine、10％牛胎児血清（ESグレード）含有DMEM
MEFは播種してから24時間後では十分に広がっていないため、２日後以降に使用する方が望ましい．継代する前に、事前にヒトES用培地に交換をしておき、MEFをヒトES培地になじませておくとよい．
生着には時間がかかる場合もあるので、48時間はできるだけ静置しておくのが望ましい．そのため培地を7mlにしている．
ヒトiPS細胞培地は、必要以上に37℃ウォーターバスに放置しないこと．
平日は毎日培地交換を行うが、週末は土曜日か日曜日のどちらか１回のみにしている．ただし、その場合、コンフルエントでない状態にしておく必要がある．

cellbank@nihs.go.jp

Last update: 2009.Apr.2.

凍結ヒトiPS細胞の解凍の手順

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