ＪＣＲＢ細胞バンク：古江-楠田美保

２００９．４．２．

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1. 準備するもの
   ・液体窒素

   ・25cm²フラスコ：Corning #430639^（注1）

   ・0.1%ゼラチン溶液：ミリポアEmbryomax #ES-006-B

   ・MEF用培地

   ・ヒトiPS細胞用培地

   ・ヒトリコンビナントFGF-2：Sigma F0291

   ・15ml用遠心チューブ

   ・50ml用遠心チューブ

   ・37℃ウォーターバス

   ・マイトマイシンＣ処理済みC57/BL6 mouse embryonic fibroblast(MEF)

   （液体窒素保存）^（注2）

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2. 準備
   1. 25cm²フラスコに0.1%ゼラチン溶液を2mlずつ入れる.

   2. 37℃インキュベーターに３０分静置　（室温の場合、２時間以上）.

   3. MEF用培地を作成^（注3）.

   4. ゼラチン液を吸引.PBSにて洗浄.各フラスコにMEF用培地を4mlずつ入れる.

   5. 15mlチューブにMEF培地を9ml入れる．

   6. 液体窒素に入れたまま凍結MEFバイアルをクリーンベンチ近くに持ってくる．

   7. バイアルの蓋をクリーンベンチ内で開けてバイアルのN₂を抜く.

   8. 37℃ウォーターバスに入れ、半分ぐらい溶解状態でクリーンベンチ内へ移動し、MEF培地でピペッティングしながらすばやく溶解．

   9. MEF浮遊液を15mlチューブに入れる．

   10. 1000rpm で３分間遠心

   11. 新しいMEF用培地にMEFを浮遊させる.

   12. MEF細胞浮遊液を1mlずつ各フラスコに入れる．

   13. MEFをCO₂インキュベーターに入れて、２４時間培養．

   14. MEF用培地からES用培地(FGF-2なし)に交換し、２４時間培養^（注4）．

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3. 細胞継代
   1. 培地を吸引する。

   2. 1unit/ml Dispase (Roche/ 解凍後３日以内に使用)を1ml入れる^（注5）．

   3. ３〜１０分間^（注6）、37℃・CO₂インキュベーターに入れてインキュベーション．

   4. Dispaseを吸引．

   5. ヒトiPS細胞用培地10mlを入れて、10mlピペットをつけたピペットエイド（強にする）で培地を吹きかけるようにしてコロニーをはがす（できるだけ回数を少なくする。２回程度のピペッティングでコロニーがはがれないような場合は、セルスクレーパーを使用してコロニーをはがす）．

   6. 顕微鏡でコロニーの分散状態を確認する．

   7. 15mlチューブに細胞浮遊液を入れて、２分間、300rpm　にて遠心（大きいコロニーのみを回収する）．

   8. 新しいヒトiPS細胞用培地を入れて細胞浮遊液とする（ピペッティングはしない）．

   9. MEFの培地を吸引．

   10. 各フラスコに細胞浮遊液を入れる (Splitの割合は株による)．

   11. 顕微鏡でコロニーの分散状態を確認．

   12. ２４時間、CO₂インキュベーターに入れて培養．

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4. 培地交換
   1. 接着率が悪い株の場合、翌日の培地交換は行わない場合もある.

   2. 培地交換に必要なヒトiPS用培地をチューブに分取し、FGF-2を入れる．

   3. 37℃ウォーターバスで培地を温める^（注6）．

   4. 細胞の状態を顕微鏡でチェック．

   5. 温めた培地を取り出す．

   6. フラスコの培地を吸引．

   7. 温めた培地を入れる．

   8. 細胞の状態をチェック．

   9. CO²インキュベーターに入れて、培養．

   10. 基本的に毎日培地交換を行う^（注7）．

1. メーカーによって細胞の生着率や継代時のディスパーゼの処理時間なども変わってくる．BD、スミロンは、Corningとほぼ同等．

2. 成育医療センター樹立iPS細胞は、C57/BL6マウスのMEFを使用して樹立されている．市販のものでは、マイトマイシンC処理済みHygro Resistant Strain C57/BL6（ミリポア）が使用可能であることを確認している．MEFバイアル１本を30枚の25cm²フラスコに播種している．ただし、ロット差があるため、新しいロットの際には、密度を変えて播種してチェックする必要がある．

3. high glucose, L-gluthamine、10％牛胎児血清（ESグレード）含有DMEM

4. MEFは播種してから24時間後では十分に広がっていないため、２日後以降に使用する方が望ましい．継代する前に、事前にヒトES用培地に交換をしておき、MEFをヒトES培地になじませておくとよい．

5. Dispaseの活性は解凍後３日以後急激に低下する.細胞分散の処理時間を一定にするためには、要時解凍して使用するのが望ましい．また、提示されている酵素活性が同様であっても、会社によって微妙にその活性は異なる．当細胞バンクではRoch・Dispase 1unit/mlで使用できることは確認している．MEFのロットによって、Dispase 1unit/mlｘ１ｍｌでは、細胞がはがれてこない場合もあり、その場合には２ｍｌに増やして時間は１０分以上は作用させないようにする．

6. Dispaseに対する感受性は株によって異なる．新しいロットのDispaseあるいは新しい細胞株の場合には、まず、3分37℃で処理して顕微鏡でコロニーの状態を確認する。ES、iPS細胞のコロニーのエッジが光って、少しだけ丸くカールしていたら、すぐにDispaseを除く。コロニーが巻きあがるようにカールしている場合には処理時間が長すぎる．その場合、簡単に揺らしただけでコロニーがはがれてしまう可能性があるため、Dispaseは吸引せずに、培地を加えて遠心してディスパーゼを除く．２〜３回培地で洗った方が生着率が良い．

7. 平日は毎日培地交換を行うが、週末は土曜日か日曜日のどちらか１回のみにしている．ただし、その場合、コンフルエントでない状態にしておく必要がある．