染色体標本作製プロトコール

• KaryoMax Colcemid Solution（GibcoBRL 10ug/ml; Cat. No. 15210-040）

• 1ml ツベルクリン注射針付きシリンジ

• 15ml チューブ

• 駒込ピペット（3ml、5ml、10ml）

• ピペット豆

• メスシリンダー（100ml）

• メタノール

• エタノール

• 酢酸

• 低張液 0.075M KCl（略してK）

• 低張液 1%(W/V) クエン酸-3-ナトリウム（略してC）

• スライドグラス（Matsunami; S-2111）

• ピンセット

• プラスチック容器（スライドグラス保存用）

• ポリエチレンビニール袋

• マジック

• 鉛筆

• その他

II．方法

1. 手順の概要
   1. 細胞培養

   2. コルセミド処理

   3. 細胞の回収

   4. 低張処理

   5. カルノア固定

   6. スライド作成

   7. スライドグラスの保存

      詳細な手順は以下の通り。通常培養している様々な種類の細胞に対応できるようにしたが、細胞によっては多少修正を要する場合もあるので注意すること。

2. 染色体標本作製プロトコール
   1. 60m/m または100m/m dishに細胞を播種し、継代培養する。その際、培養液量をチェックしておく。

   2. 細胞の対数増殖期を見計らって、コルセミド溶液（10ug/ml）を1mlシリンジにて添加する。添加する量は、培養液2.5mlあたり中〜大粒1滴（約10〜20ul）を滴下する（最終濃度約0.04〜0.08ug/ml；ロットごとに最適条件を決めておく）。

   3. 培養を継続し、増殖速度に応じて、コルセミド処理の時間を決める。通常2時間程度（30分〜6時間）。

   4. 細胞を15mlチューブに回収する。接着性細胞の場合は、トリプシン処理の時間を短めにする。また、最適低張液の組成が未知の場合は、細胞懸濁液を数本に分けておく。

      （例）４等分した場合；C:K=4:1、C:K=1:1、C:K=1:4、KClのみ など

   5. 遠心1200 rpm室温 5分間の後、上清をデカントで捨てる。

   6. 低張処理を行う。最初1mlの0.075M KClのみで各チューブのサンプルを懸濁させ、次に予め設定しておいたC:Kの比率になるように総量5mlの低張液を加える。

   7. 37℃インキュベーター内にチューブを寝かせて、22分間静置。

   8. カルノア液（メタノール:酢酸＝3:1）を調整し（用時調整、1時間以上経ったものは使用しない）、各チューブに1mlずつ加え、駒込ピペットで静かに混和させる。

   9. 遠心1200 rpm室温 5分間の後、上清をデカントで捨てる。

   10. カルノア液を各チューブに5mlずつ加え、駒込ピペットで混和させる。

   11. 遠心1200 rpm室温 5分間の後、上清をデカントで捨てる。

   12. カルノア液を各チューブに5mlずつ加え、駒込ピペットで混和させる。

   13. 遠心1200 rpm室温 5分間の後、上清をデカントで捨てる。

   14. カルノア液を各チューブに0.5mlずつ程度加え、駒込ピペットで混和させる。

   15. スライドグラス上にカルノア液の細胞懸濁液を展開させる（詳細は口述）。

   16. 各スライドグラスの右端に、日付、細胞名、細胞番号、ロット番号、C:Kの比率、スライド番号を表記し、2枚ずつペアでセロテープで留め、ポリエチレンの袋に封入する（ポリシーラー）。

   17. 使用時までフリーザー内（−20℃または−80℃）で保存する。