細胞培養の培地に血清を加えるのは何故か？　何故ウシ血清なのか？

これは、動物生体内の組織や細胞を試験管内という人工的な環境に移すことを思いついた先人たちが、生体に近い条件を作り出すために血漿、血清、組織液を選んだことが始まりでしょう。そして、培養技術としては先行していた、細菌培養に血清が使われていたことが、実用化への近道だったのではないでしょうか。ウマやウシは大動物で（血液が大量に採れる）、入手し易い（安価）、品質が管理できる（飼育）ことなども有利だったと思われます。私が組織培養を始めた頃の伝染病研究所には“採血部”があって、ウマやウシの血清が大量に供給されていたことを思い出します。

ウマが良いか、ウシが良いか、同種が良いかといったことは、多くの研究者たちの実験結果に依存しています。1950年代には鶏かウマでしたが、かなりの早さでウシになり、仔牛になり牛胎児になり、今では細胞培養を始めるにあたっては、先ず牛胎児血清を購入するのが常識になっているようですね。私共の実験結果の中には、ラットの腹水肝癌の培養内での増殖にウマよりウシが良かったというデータがあります。

1950年代の論文を集めて調べれば、多くの実験例があると思います。現実問題としては、戦後の組織培養はアメリカが先行していましたから、胎児血清の入手となると、当然ウマよりウシが商品化に適していたということも考えられますね。インドから来ていた留学生がウシ血清は使わない、ヒトの血清を使う（ヒトの組織の培養が主でしたが）と言っていましたから、それぞれの国では異なった条件もあるかも知れません。

では、細胞培養培地に血清を加えることの利点と欠点について考えてみたいと思います。利点は、

1. 増殖因子と接着因子の供給

2. 毒性物質の作用の中和

3. 低分子微量成分の供給

4. pHの緩衝作用

5. 細胞膜の合成

などに役に立つことです。欠点は、培養細胞が培地中へ放出する物質の同定や精製が困難なこと、細胞の代謝や合成に血清の影響を除けないことなどがあります。未だに血清の良否が実験に影響するということも欠点の一つでしょうか。

そして、無蛋白培地で細胞を培養するときの利点は、血清培地の欠点を裏返したものでもあります。その一つ、培養細胞が培地中へ放出する物質の同定や精製が簡単に出来た実験として、梅田誠博士らの“無蛋白無脂質培地で生育する細胞の放出する諸因子”についての一連の報告があります。私共のP3 系細胞を使って、成長因子、接着因子、CSF、TGFなど種々の高分子生理活性物質の産生を確認したものです。細胞系によって、それぞれ特徴があり、培養細胞の多様性を示しています。

又、血清を使わない培養でこそ出来た実験の一つは細胞の脂質代謝に関するもので、香川靖雄博士の多くの論文が発表されています。

では血清を加えることの諸利点を“血清を加えなければ得られないか”という立場から考えてみたいと思います。

1. 増殖因子と接着因子の供給、については梅田博士らの研究で判っているように、血清の関与なしに幾系かのP3 細胞が培地中にそれらを放出しています。

2. 毒性物質の作用の中和、については私共の1960年代の実験でL・P3 胞(L-929の無蛋白培地系）が他の血清培地系の細胞よりも、4NQOに対する耐性が高かったということを確認しています。それが解毒作用であったのか、代謝の違いかは判りませんが一概に“毒物に弱い”とは言えません。

   しかし又、私が1983年に培地に使う水について調べたとき、或都市の水道水で作った培地は、無血清では細胞が死滅してしまうのに、血清を添加すると、純水で作った培地と遜色ない増殖を示しました。これは血清の中には、何らかの解毒作用をもつ物質が含まれていることを、明らかに示しています。

3. 低分子微量成分の供給、はその通りですが、低分子微量成分はハム博士の主張のように、鉄、銅、亜鉛、亜セレン酸などを合成培地へ添加することで充分な良い成績が得られます。

4. pHの緩衝作用、も合成培地では血清培地に適いません。しかし劣ってはいても、致死的な欠陥であるとは思われません。

5. 細胞膜の合成、これは香川博士の長年の研究から判るように、生体内ではあり得ない無脂質という環境で増え続けたP3 細胞は、生体内では不可欠な膜構成の脂肪酸のあるものが欠損し、その脂質代謝は生体のそれとはかけ離れています。

血清を加えなくても細胞は長期間培養できることを裏付けるものに、血清を含まない培地で、凍結することなく、長年（長いものでは30年以上）培養を続けてきたP3 系があります。P3 系は、私共の研究室で1950年代に作られた無蛋白培地系の一つです。

P1系はラクトアルブミン加水分解物(L)、イーストエキストラクト（Y）、ポリビニールピロリドン（P）を私共の処方した塩類溶液（D）に溶かした培地、LYD+Pに駲化した系でした。

LYD系は P2、完全合成培地系は P3 LD+P培地系は P4と命名され、現在は P3 だけが生き残っています。皮肉なことに、培養細胞はどの血清成分を要求しているかという研究の結果生まれた細胞系です。

それらの細胞系は梅田博士、香川博士の実験に使われましたし、幾つかの系は細胞バンクに登録されています。さらに登録されていない幾つかの系がありますが、これらの系の欠点は、大変神経質なことです。継代時の細胞数が足りないだけでも死滅することがあります。また光に弱いこと、増殖が遅いこと、継代に酵素が使えない（酵素は蛋白質ですから）ことなどかなり扱い難い細胞系です。

無血清培養化のヒント

無血清細胞の場合は系として分与するより、血清培地系でも、割合簡単に無血清に駲化させられる方法を述べる方が、参考になるのではないかと思いましたので幾つかの要点を述べます。

先ず培地は、すでに述べたように微量成分を含むハムのF12がよいのですが、継代用無蛋白培地としてはアミノ酸濃度が低すぎるようです。

市販の無血清培地の多くが、ハムF12とアミノ酸濃度を高めたDMEM培地とを混合して処方されているのはそのためだと思います。私共は自前のDM培地の中、血清培地から簡単に切り替えられる培地としてDM-201を使っています。

継代法は、血清培地の酵素による分散、増殖率に合わせた稀釋をそのまま応用できません。分散はラバークリーナー（ラバーポリスマン）で機械的に剥がします。機械的に剥がしたときの細胞障害が系によって異なりますので、単純に稀釋すると次代が生え出さないことになります。

無血清への切り替え初期には、細胞数の増加過剰を剥がしとって、剥がし残した細胞に新しい培地を加える（普通には剥がしたものを次代へ移すのですが）方法が安全に維持できます。

培地内へ高分子の生理活性物質を放出していることが、彼らの生命維持のための知恵かも知れず、培地更新は週２回くらいが適当だと思います。半量更新などが、系の維持に効果を示すこのもあります。 この継代法が理想的とはいえません。不利な点は、継代直後の細胞数が少ない時のpHの上昇、ラバークリーナーによる細胞分散ではバラバラにならず細胞集塊として植え継がれる系のあること、などです。

非必須アミノ酸を加える意味は？

　培養細胞の栄養要求が検索されるより以前に、生体内で作れないアミノ酸としての必須アミノ酸が調べられていて、その基礎の上にイーグル先生は培養内での必須アミノ酸を実験的に決定されました。そのころ(1950年代）の培養可能な細胞系はＬやHeLaでしたが、現在では数多くの細胞系が培養可能になっており、それらの栄養要求は多様です。

例えばアスバラギンを要求する系、プロリンを要求する系などは、若し透析血清＋ＭＥＭ培地で培養すれば増殖など得られません。そこで“非必須”アミノ酸添加培地が良い培地として脚光を浴びたと思います。

しかし、13種の必須アミノ酸以外を非必須あるいは可欠アミノ酸と称していながら、培地へ添加するのは、何やら奇妙な感じですね。

イーグル先生は透析血清を添加してアミノ酸要求を調べておられましたが、勝田甫博士は透析血清からも培養中にアミノ酸が遊離してくるという論文を目にして、アミノ酸要求を知るには無蛋白培地でなくてはならないと強調されました。

そして、私共の実験結果としては、無蛋白培地で可欠アミノ酸を添加することによって、細胞の増殖度が高くなることが分かりました。培養内の細胞たちは、与えられなければ合成するが、与えられれば利用してその労力を他へ回しているのだと思われます。

ここで、また水沢さんから、疑問が提出されました。無蛋白培地といっても、死んだ細胞からの遊離アミノ酸を利用してはいないか？　それは否定できません。P3 系は20種のアミノ酸をたっぷり処方してありますから、“非必須”アミノ酸を培地中の死細胞から調達する必要はありませんが、“非必須”アミノ酸要求を追求する実験では、問題になるかも知れません。

１９９９年９月
高岡聰子