【同型培養、純培養（クローニング）、同調培養】

高岡聰子

同型培養

動物実験でいうならば、同腹の動物を使うことに似ています。複数の同型の培養容器（試験管、シャーレ、培養瓶、マルチウェルなど）に、一つの母集団としての細胞浮遊液を均一に分注することによって、複数の同型の細胞培養が用意できます。実験目的に従って、容器は何を使うか、総培養日数を何日間にするか、何日おきに計数するか、１点をプロットするのに何個の培養を使うかなどの基本条件を設定して実験を開始します。

この実験法は細胞の『増殖率』を得る方法で、定量的な増殖曲線を描くことができます。全培養を同型とみなして、その一部を代表として細胞数あるいは細胞核数を数えるわけですから、細胞浮遊液の作り方、その分注法、細胞数あるいは細胞核数の計数の精度が定量実験としての精度に関わってきます。実験者はそれぞれ自分の実験精度を検定しておく必要があります。

この方法は細胞浮遊液をつくることができる培養細胞であれば、初代、不死化にかかわらず使えます。しかし、初代培養では同型であっても、その内容は純培養ではありませんから、長期間の実験では内容が質的に変化する可能性もあります。例えば細胞を分別しない骨髄の初代培養では、培養開始時には血球細胞が計数され、培養後期には繊維芽細胞が優勢になるという経験もありました。

純培養

これは細胞培養の成功によって得られた特殊な生物実験材料と言えましょう。動物実験でも純系動物を使えば、固体差が少ないので、格段に精度の高い実験ができます。細胞培養ではたった１個の細胞から増殖し、遺伝的に均一な細胞集団として扱うことができ、培養細胞の物質生産、形質転換、栄養要求などについての沢山の問題解決に役立ちました。先駆者のアール一門の研究者が何年もの年月をかけて、１個の細胞からの培養系樹立の可能性を証明してから半世紀が過ぎています。今では熟練すれば、おそらく誰でもできる技法だと思います。毛細管に１個の細胞を吸い上げる古典的な方法だけでなく、細胞浮遊液を限界まで稀釋して１滴の培地にあるいは１個の培養容器に細胞１個を入れて培養する簡便な方法も使われています。シャーレ当たり10〜100個といった少数の細胞を接種して、もしコロニー形成率が100％であれば、個々のコロニーは１個の細胞から成り立っているという計算になるわけですから、１個の細胞由来のクロンを拾うことも日常の実験手段になっています。

とはいってもコロニー法では、細胞がそれぞれ１個ずつに分散されていること、培養開始時に１個ずつが孤立していることを確認しておくことが必要です。１個釣りの場合と異なりコロニアルクローニングは３回繰り返さないと純培養とはいわないという意見もありました。産生される物質に価値をおくモノクローナル抗体産生クローンの分離は、稀釋法で各ウェルに１個宛細胞を分注するマルチウェル法が有効に使われています。

クローンの拾い方も、色々と工夫されたものでした。1974年代の勝田グループの仕事を振り返ってみますと、細菌培養でのコロニーレプリカ法に習って、寒天上に作らせた培養細胞のコロニーのレプリカを作り、栄養要求性の異なるもの、放射線や化学発癌剤による変異系を拾うことに全力を挙げていたようです。

同調培養

無血清培地で継代できるL929の亜株L・P1細胞を使って同調培養をやってみるようにと命じられたのは1962年のことでした。細菌学の分野では、高密度低栄養で培養した栄養飢餓状態の細菌を、継代して豊富な栄養を与えると細胞が一斉に分裂することがわかっている、培養細胞でも同じ方法で同調するかどうか試すようにとのことでした。そのころはまだ合成培地を使っていませんでしたから、母培養は継代培地のラクトアルブミン・イーストエキストラクト・ポリビニールピロリドン培地で高密度培養でしばらく維持し、分裂しなくなったところで、細胞をかきおとして同型培養に移しました。

L・P3はほぼ24時間周期で分裂していましたから、見当をつけて何時間か毎にサンプルを取り細胞核数を数える日々でした。毎日々々、昼も夜もけじめがつかないような実験でした。今思うと幼稚な情ないような実験ですが、莫大な実験の中では、２時間の間に細胞数が倍加したものが幾つかあってどうやら論文にまとめられました。多分シングルセルクローンＬ株なればこその成功であったと思います。

その後、組織培養学会で寺島先生の目の覚めるような実験結果を見せて頂きました。それはHeLa細胞の塗抹標本の顕微鏡写真でした。視野一面のHeLa細胞は全部分裂期でした。雑誌・組織培養の1990年16巻8号「同調培養と私」寺島東洋三の項を読むと先生のご苦労がよくわかります。今も世界的に有名な「寺島法」です。分裂期の細胞が球形化して剥がれやすくなる性質を利用して、一切人工的な操作を加えずに、生理的条件に近い分裂期の細胞が集められる方法という利点がある一方、大量細胞の同調や浮遊系細胞には適していません。

現在では、細胞周期の研究が進んで、各期に適応した阻害剤（DNAポリメラーゼ阻害のアフィジコリン、G1G2両期に作用するトリコスタチン、レプトマイシン、分裂期でとどめるコルヒチンなど）を使ってのG1/S期やM期同調が可能です。

またエルトリエーターやセルソーターといった装置を使えば、各時期の細胞の大きさや質量の違いによって分劃することもできるようになりました。この方法は浮遊系の細胞でも使えることが強味です。

「同調培養」の項をもつ組織培養技法の教科書が多いことをみても、同調培養は細胞培養技法なればこその技法だと思われます。　

css