ＪＣＲＢ細胞バンク：大西清方
cellbank@nihs.go.jp
1995.Nov.27

汎用される培養液と調製法

次の５種類は使用頻度の高い培養液であり、通常は市販の製品を使用する．しかし，メーカーや製品ごとに仕様が異なる場合もあるので，標準的な調製法について十分に理解し正確な知識を持っておく必要がある．

培地名	略称
Basal Medium, Eagle	BME
Eagle's Minimum Essential Medium	EMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	DME
RPMI-1640 Medium	RPMI1640
ES Medium	ES

これらの培養液のうち BME を除く 4 種類，EMEM, DME, RPMI-1640, ES の各培地は，高圧滅菌 可能な粉末培地として，日水製薬株式会社などから販売されている．最近 Basal Medium, Eagle は，日水製薬株式会社では製造を中止した．

市販されている培地には高圧蒸気滅菌が可能なものと不可能なものがあるが，マイコプラズマによ る汚染の問題を考慮すると，高圧蒸気滅菌可能な培地を使用することが望ましいので，それを中心に 記載する．濾過滅菌をしなければならない場合は，調製段階でマイコプラズマが混入しないよう,十分な注意を払うことが必要である．

また，日水製薬株式会社の製品には，抗生物質，カナマイシン，が添加された製品と，無添加の製 品がある. 通常の研究には抗生物質を添加した培養液を使用して構わないが，細胞バンクでシードカ ルチャーとして長期保存を目的とするような場合は，出来る限り抗生物質を含まない製品を使用すべ きであり，頻繁に汚染検査をくり返すなどの注意深い取り扱いが必要である．抗生物質無添加の製品 の日水製品のコード番号は MEM（code 05902）、 DME（code 05919）、RPMI-1640（code 05918） となる．これ以外のコード番号を持つ製品にはカナマイシンが添加されているので注意されたい．

大日本製薬株式会社製の高圧蒸気滅菌可能な製品は, Auto-pow, MEM-Earle(No. 11-100-20), Auto-pow, MEM, suspensionculture (No.11-170-20) である．

使用頻度からすると，最も多用されるのは EMEM で，次いで RPMI-1640，DME であり，BME, ES 各培地の使用頻度は比較的少ないようである．

高圧蒸気滅菌可能な粉末培地の使用法

前記の 4 種類の培地は 100 g 瓶で購入し，使用するまで 4 ℃ の冷蔵庫に保管する．使用頻度 の高い培地は必ず 2 本程度を常備し，緊急時にあたふたしないよう心掛ける．

保存培養液の一般的な調製法

1. 使用前に室温，または 50 ℃ 以下の乾燥機に瓶ごと入れて常温に戻す．常用量として 1 L 分 を秤量し，200〜300 ml のビーカーに水を 8 分目程度入れて，マグネチックスターラーで撹拌する．

2. 1 L メスフラスコに水を 600〜800 ml 入れ，ビーカーの内容物をメスフラスコに流し込む．約 50 ml 程度の水で 5〜6 回ビーカーを洗い出し，全量をメスフラスコに流し込む．その後水を足して目盛り線を合わせ，スターラーにより約 30 分ほど撹拌する．

3. 100 ml のメスシリンダーを使用し，正確に 100 ml ずつ 10 本のガラス瓶に分注する．綿栓またはスクリューキャップをつけ，蓋をゆるめて高圧蒸気滅菌する．綿栓を付けるときはアルミ箔、または硫酸紙などで瓶の口を覆う．滅菌時間に注意し，瓶が均一に且つ充分に加熱されるよう注意する．

4. 高圧蒸気滅菌器の圧力が十分に低下してからガラス瓶を取りだし，スクリューキャップの場合 はきつく締めてから、瓶に培養液の種類，日付を記入して無菌室内のガラス戸棚に収納して室温で保存する．綿栓を付けたガラス瓶で滅菌した場合は，高圧蒸気滅菌したシリコン製のゴム栓に付け換えておく．なお、瓶を無造作に扱い瓶中の液体が蓋に付着しないよう注意を払うこと．

5. 使用に際しては，表７に従って規定量のグルタミン，NaHCO3 その他を必要に応じて添加しなければならない．

無菌試験

調製された培養液は，使用する前に無菌試験を実施することが好ましい．無菌試験用の培地には，真菌類検出用の培地としてブドウ糖ペプトン培地(栄研化学株式会社)，または Bacto Nutrient Broth(DIFCO, 三光純薬扱い), 一般細菌試験として嫌気性菌，好気性菌を同時に検出する培地として Thioglycollate Medium, fluid(DIFCO, 三光純薬扱い)を使用する．説明書にしたがって培地を調製し，直径 2 cm, 長さ 12 cm の試験管に 15 ml ずつ分注して 120 ℃, 15 分の高圧蒸気滅菌をする．Thioglycollate Medium は滅菌終了後直ちに流水で冷却する．Thioglycollate Medium の試験管の上部には Resazurin の赤い色調が狭いバンドとなって出現する．

調製された培養液 1 ml づつを前記のブドウ糖ペプトン培地または Bacto Nutrient Broth,および Thioglycollate Broth に添加する．ブドウ糖ペプトン培地または Bacto Nutrient Broth は 25〜27 ℃ で 10日間，Thiglycollate Medium は 37 ℃で 1 週間培養する．微生物の増殖は目視的に判定出来る．

Thiogllycolate Medium の試験管上部の Resazurin の赤い色調が消失し，濁りを生じたら好気性菌が増殖したことを示し，試験管の深部に濁りを生じたら嫌気性菌が増殖したことを示す．

培養細胞にはその細胞に最適の種々の培養液，および各種の動物血清が指定されている.Eagle's Basal Medium(BME), Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM), RPMI-1640 Medium, Dulbecco's Modified Eagle's Medium 以外に各種のアミノ酸，ビタミン類，その他を含む種々の合成培養液が普及し，かつ安価に入手出来るようになった．それに伴ない培養できる細胞種も飛躍的にまた広範囲に増大した．現在種々の細胞株に一般的に汎用され，入手可能な各種合成培養液は表のとうりである．

市販粉末培地を使用する際の注意点

1. 合成培養液一覧表に記載されている培地で，粉末の製品を購入するときは，その包装単位を確かめねばならない．通常は１L,５L,１０L 用のアルミ箔ラミネート包装になった製品である．粉末培地を溶解するときは，アルミ箔ラミネート包装の内壁に付着した粉末も全て水で洗い出して溶解しなければならない．

2. 使用頻度が少ない培養液を調製するのに，大容量の包装単位の粉末培地を購入するのは不経済である．また大容量の包装単位から小出しして使用することは，品質の安定性を考慮するとき好ましい方法とは言えない．

3. 大容量用の粉末培地，例えば１０L 用の粉末培地を購入したときは，５又は１０倍濃縮した培養液として２L 分を調製して 200 ml ずつに分注しておくなどとすると便利である．溶解した培養液は密栓して−２０ ℃で凍結保存し，実際に使用するまでグルタミンや重炭酸ナトリウムなどを添加してはならない．培地中の金属イオン成分が炭酸と錯塩を作り不溶性の沈殿を作るためで、濃縮培地では特にこの注意が重要である．

4. 使用するときは 200 ml に小分けした瓶１本を温水で解凍し，正確に希釈して１L とする．希釈後規定量のグルタミン，重炭酸ナトリウムなどを添加する．オートクレーブをかけられない培地の場合は、添加後０.２ｕｍのメンブランフィルターで濾過滅菌する．

   オートクレーブ滅菌する場合はグルタミン・重炭酸ナトリウムを添加する前に滅菌する．

css