国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 JCRB細胞バンク

HL60細胞の解凍と培養について

ヒト血球系細胞株は一般的に解凍からの増殖の立ち上がりが悪く、HL60細胞ではこれが特に顕著です。場合によっては解凍時のショックで死滅してしまう場合があります。念のため以下の点に留意してみて下さい。

凍結状態の細胞は-80度以上の温度にさらされますと、それが短時間であっても急激に生存率が低下します。このため、解凍速度がかなり生存率に影響します。解凍は37度程度の微温中で振蕩することに急速に行って下さい。解凍までに1-2分が目安です。解凍後のDMSOを除くための遠心は1000 rpm　一回にとどめてください。

HL60細胞株の解凍からの増殖がうまくゆくかどうかは、細胞密度に依存することが多いです。これは、細胞自身が放出するautocrine factorの影響と考えられます。そこで、解凍からの最初の培養においては、局所的に細胞密度を高くしてやる、たとえば5mlの培地で培養を開始し、フラスコを傾けて角に細胞が集まるようにすることにより、増殖を促す効果が期待されます。バンクでは平坦な状態で解凍後の生存・増殖を確認はしていますが、念のためお試しください。

また、血清濃度を一時的に20%にしてやることも効果があります。同様の理由で、頻繁な培地交換はむしろautocrine factorの希釈につながり、立ち上がりが悪くなる原因となり得ます。解凍時にDMSOを除くための遠心を一度行ったら、培養開始後は増殖が確認されるまで培地交換はむしろ行わない方がよい結果が得られます。死細胞が増えたとしても増殖を始めるまでは培地交換も頻繁には行わず、培地の色が黄色になるまで放置して下さい。また、細胞が対数増殖期に入るまで、１週間以上かかることもよくあります。凍結直後の継代は、細胞がある程度フラスコを覆うまで待ち、様子を見ながら1:1くらいから始めて下さい。継代時には、それまでに培養されていた培地をそのまま新鮮な培地に対して希釈してください。

解凍時・再培養時には高pHが強いダメージを与えます。基礎培地のRPMI1640は、pHが高くなりやすい傾向がありますのでインキュベーター中の培地のpHに注意してください。もしインキュベーター中でのpHが高めになるようでしたら、予めpHを低めにRPMI1640を調製してください。

抗生物質としては、100 units/ml penicillin & 100 μg/ml streptomycin あるいは50 μg/ml kanamycin の使用は問題ないと思います。しかし、もしFungison (amphotericin B)やgentamaicinを使われている場合は特に前者の使用を避けてください。影響は少ないと思いますが、いずれの細胞に対しても増殖阻害的に働きます。



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[The cultivation of HL60: Tips for recovery after thawing.]

Human haematopoietic cell lines often fall into growth problem after thawing. This tendancy is prominent for HL60 cell line, and sometimes the most of cells will die due to the shock by thawing. To improve the condition of cells, please take care the following matters.

The viability of frozen cells rapidly decrease by the exposure to the temperature higher than -65C even the exposure time is short. Therefore the frozen vial should be immediately thaw after taking from dry ice, or freezer/liquid nitorgen tank. The thawing should be made rapidly by immersing the vial to the 37 C water bath within 1-2 min. It is essential to remove DMSO after thawing by centrifugation (1000 rpm, 3-5 min). Repeated centrifugation is not necessary.

The growth of HL60 cell line tend to depend on high cell density. This is because the cell line itself secretes the growth factors and survival factors in the culture media. The most simple method will be slant culture. The flask is slanted so as to achieve the local high cell density in the bottom of flask corner.

The autocrine factor(s) may be substituted by serum. Therefore, please increase serum concentration in culture medium to 20% until the cells stably grow.

By the same reason, excessive dilution or too frequent medium renewal may become rather harmful to cells. Simply add the medium to the old medium with cells.

The pH of RPMI1640 medium tends to become alkaline. The alkaline pH is very harmful for HL60. The media color indicated by phenol red should be orange. If the medium color is pink or purple, it is not suitable. If the pH of culture medium in CO2 incubator is too high, please prepare the RPMI1640 medium to somewhat lower pH.

The addition of 100 units/ml penicillin & 100 ug/ml streptomycin, or 50 ug/ml kanamycin is no problem. However, if you use amphotericin B + gentamycin, please avoid to use (especially amphotericin B). These sometimes inhibit the growth of cells.

 
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• 08192010
• 04282009
• 11182005
• 11062001
• 042197
• 051496
• 031495
• 073093
• 080493
• 080593
• 091792
• 042092
• 062091
• 090790
• 051590
• 101189
• 080687
• 043097
• 02082016
• 02152018
• 04092019
• 07072022

細胞番号	JCRB0085	細胞名	HL60
培養ロット番号	042197	培養種別	distribution
培地	RPMI1640 medium with 10% or 20% heat inactivated fetal bovine serum (Cell Culture T.1604309).	培養温度	37 C
継代時細胞数（濃度）	2x10^5 cells/ml	継代方法	Simple dilution, because of a suspension culture.
増殖速度	NT	凍結時生細胞濃度	1.93x10^6
凍結時生細胞率	96.3	使用抗生物質	free
継代数	P10*	PDL数（プライマリ）	NT
ﾏｲｺﾌﾟﾗｽﾞﾏ検出	-	細菌汚染検出	-
真菌汚染検出	-	ｱｲｿｻﾞｲﾑ検査・動物名	NT
染色体モード	NT	染色体情報	Under investigation.
表面抗原	NT	DNA Profile (STR)
接着性	No	導入外部遺伝子	NT
凍結培地	Culture medium with 5% DMSO.	炭酸ガス濃度
解凍後生細胞率		追加情報

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細胞番号	JCRB0085	細胞名	HL60
培養ロット番号	051496	培養種別	distribution
培地		培養温度
継代時細胞数（濃度）		継代方法
増殖速度		凍結時生細胞濃度
凍結時生細胞率		使用抗生物質
継代数		PDL数（プライマリ）
ﾏｲｺﾌﾟﾗｽﾞﾏ検出	-	細菌汚染検出	-
真菌汚染検出	-	ｱｲｿｻﾞｲﾑ検査・動物名
染色体モード		染色体情報
表面抗原		DNA Profile (STR)
接着性		導入外部遺伝子
凍結培地		炭酸ガス濃度
解凍後生細胞率		追加情報

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細胞番号	JCRB0085	細胞名	HL60
培養ロット番号	091792	培養種別	distribution
培地	RPMI1640 medium (081792) with 10% fetal bovine serum (Hyclone 11151031)	培養温度	37 C
継代時細胞数（濃度）	1.1-1.5x10^5 cells/ml	継代方法	Simple dilution
増殖速度	NT	凍結時生細胞濃度	1.37x10^6
凍結時生細胞率	94.9	使用抗生物質	free
継代数	P7* =correct.	PDL数（プライマリ）	NT
ﾏｲｺﾌﾟﾗｽﾞﾏ検出	-	細菌汚染検出	-
真菌汚染検出	-	ｱｲｿｻﾞｲﾑ検査・動物名	NT
染色体モード	M=46	染色体情報	NT
表面抗原	NT	DNA Profile (STR)
接着性	No	導入外部遺伝子	NT
凍結培地	Culture medium with 5% DMSO.	炭酸ガス濃度
解凍後生細胞率		追加情報

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