JCRB細胞バンク：古江-楠田美保
Last update: 2009.Apr.2.
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準備するもの

  • 液体窒素
  • 25cm²フラスコ：Corning #430639（注1）
  • 0.1%ゼラチン溶液：ミリポアEmbryomax #ES-006-B
  • MEF用培地
  • ヒトiPS細胞用培地
  • ヒトリコンビナントFGF-2：Sigma F0291
  • 15ml用遠心チューブ
  • 50ml用遠心チューブ
  • 37℃ウォーターバス
  • マイトマイシンＣ処理済みC57/BL6 mouse embryonic fibroblast(MEF)（液体窒素保存）（注2）

 

準備

  1. 25cm²フラスコに0.1%ゼラチン溶液を2mlずつ入れる.
  2. 37℃インキュベーターに３０分静置　（室温の場合、２時間以上）.
  3. MEF用培地を作成（注3）.
  4. ゼラチン液を吸引.PBSにて洗浄.各フラスコにMEF用培地を4mlずつ入れ る.
  5. 15mlチューブにMEF培地を9ml入れる．
  6. 液体窒素に入れたまま凍結MEFバイアルをクリーンベンチ近くに持ってくる．
  7. バイアルの蓋をクリーンベンチ内で開けてバイアルのN2を抜く.
  8. 37℃ウォーターバスに入れ、半分ぐらい溶解状態でクリーンベンチ内へ移動し、MEF培地でピペッティングしながらすばやく溶解．
  9. MEF浮遊液を15mlチューブに入れる．
  10. 1000rpm で３分間遠心
  11. 新しいMEF用培地にMEFを浮遊させる.
  12. MEF細胞浮遊液を1mlずつ各フラスコに入れる．
  13. MEFをCO2インキュベーターに入れて、２４時間培養．
  14. MEF用培地からES用培地(FGF-2なし)に交換し、２４時間培養（注4）．

 

細胞継代

  1. 培地を吸引する。
  2. 1unit/ml Dispase (Roche/ 解凍後３日以内に使用)を1ml入れる（注5）．
  3. ３～１０分間（注6）、37℃・CO2インキュベー ターに入れてインキュベーション．
  4. Dispaseを吸引．
  5. ヒトiPS細胞用培地10mlを入れて、10mlピペットをつけたピペットエイ ド（強にする）で培地を吹きかけるようにしてコロニーをはがす（できるだけ回数を少なくする。２回程度のピペッティングでコロニーがはがれないような場合は、セルスクレーパーを使用してコロニーをはがす）．
  6. 顕微鏡でコロニーの分散状態を確認する．
  7. 15mlチューブに細胞浮遊液を入れて、２分間、300rpm にて遠心（大きいコロニーのみを回収する）．
  8. 新しいヒトiPS細胞用培地を入れて細胞浮遊液とする（ピペッティングはしない）．
  9. MEFの培地を吸引．
  10. 各フラスコに細胞浮遊液を入れる (Splitの割合は株による)．
  11. 顕微鏡でコロニーの分散状態を確認．
  12. ２４時間、CO2インキュベーターに入れて培養．

 

培地交換

  1. 接着率が悪い株の場合、翌日の培地交換は行わない場合もある.
  2. 培地交換に必要なヒトiPS用培地をチューブに分取し、FGF-2を入れる．
  3. 37℃ウォーターバスで培地を温める（注6）．
  4. 細胞の状態を顕微鏡でチェック．
  5. 温めた培地を取り出す．
  6. フラスコの培地を吸引．
  7. 温めた培地を入れる．
  8. 細胞の状態をチェック．
  9. CO²インキュベーターに入れて、培養．
  10. 基本的に毎日培地交換を行う（注7）．

 

注

  1. メーカーによって細胞の生着率や継代時のディスパーゼの処理時間な ども変わってくる．BD、スミロンは、Corningとほぼ同等．
  2. 成育医療センター樹立iPS細胞は、C57/BL6マウスのMEFを使用して樹立されている．市販のものでは、マイトマイシンC処理済みHygro Resistant Strain C57/BL6（ミリポア）が使用可能であることを確認している．MEFバイアル１本を30枚の25cm²フラスコに播種している．ただし、ロット差があるため、新しいロットの際には、密度を変えて播種してチェックする必要がある．
  3. high glucose, L-gluthamine、10％牛胎児血清（ESグレード）含有DMEM
  4. MEFは播種してから24時間後では十分に広がっていないため、２日後以降に使用する方が望ましい．継代する前に、事前にヒトES用培地に交換をしておき、MEFをヒトES培地になじませておくとよい．
  5. Dispaseの活性は解凍後３日以後急激に低下する.細胞分散の処理時間を一定にするためには、要時解凍して使用するのが望ましい．また、提示されている酵素活性が同様であっても、会社によって微妙にその活性は異なる．当細胞バンクではRoch・Dispase 1unit/mlで使用できることは確認している．MEFのロットによって、Dispase 1unit/mlｘ１ｍｌでは、細胞がはがれてこない場合もあり、その場合には２ｍｌに増やして時間は１０分以上は作用させないようにする．
  6. Dispaseに対する感受性は株によって異なる．新しいロットのDispaseあるいは新しい細胞株の場合には、まず、3分37℃で処理して顕微鏡でコロニーの状態を確認する。ES、iPS細胞のコロニーのエッジが光って、少しだけ丸くカールしていたら、すぐにDispaseを除く。コロニーが巻きあがるようにカールしている場合には処理時間が長すぎる．その場合、簡単に揺らしただけでコロニーがはがれてしまう可能性があるため、Dispaseは吸引せずに、培地を加えて遠心してディスパーゼを除く．２～３回培地で洗った方が生着率が良い．
  7. 平日は毎日培地交換を行うが、週末は土曜日か日曜日のどちらか１回のみにしている．ただし、その場合、コンフルエントでない状態にしておく必要がある．

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