《勝田報告》
発癌実験だけについて報告します。
第２表は、その後の成績で、やはり対照より実験群の方が増殖をはじめる培養が多く、Ｃ＃17では対照は0/5となっています。この前の連絡会のとき、DABをまず溶くときの血清の種類の検討が必要かも知れない、とお話ししましたので、Ｃ＃13ではラッテの血清にとき、あとの培養にも20％ラッテ血清を用いてみました。しかし結果は反って悪く、１本も増殖が起りませんでした。次のＣ＃14ではこのとき作ったDAB-RSを使い、それに培養用としては仔牛の血清（CS）を用いました。その他にはじめから仔牛血清にといたDABも作って、同時に実験をはじめたのですが、結果はラッテ血清を使うことは全く意味がないことが判りました。その他、仔牛血清で判ったことは、成牛血清に比べCSの方がむらが少いということです。BSでも良いのは良いんですが、たまに悪いのがあるので困る。CSだとそれが少いという訳です。Ｃ＃16→＃18では同腹の仔ラッテを次々と使って、日齢のeffectも同時にしらべました。すると18日ラッテがいちばん良さそうなことが判りました。つまりControlは０で、実験群の率もMaxの訳です。第２表の実験ではどれも11日にふえ出しているのが面白く、大体DAB-Liver系の発癌実験も基礎コースが終った感です。Ｃ＃18では、第15日になると増殖本数がふえました。今後は復元実験に主力をおきたいと思っていますが、ラッテの出産に左右されるので困ったものです。（このあとスライドでDABにより増えてくる細胞の位相差像を展示）TD-15瓶なのでピントが鮮明でないが、明らかに実質細胞系と思われる細胞の集団から成っている。このような細胞が活発に増えてきたときだけ（＋）としている。（箒星様の細胞はこのように相互に石垣状に密接しないし、増殖しているかどうかも判らない。運動力が大きくて、explantからmigrateするだけかも知れない。たとえ少しあらわれても継代すると姿を消す。
［山田］継代はトリプシンを使うのですか。 ［佐藤］トリプシンを使うと、Exp.とControlの差がなくなるように感じますが・・・。 ［高岡］初代→第２代のときはトリプシンを使わず、ラバークリーナーで落しています。その方が良いようです。以後の継代では、細胞が硝子面に一杯になったとき、トリプシンをうすくして使っています。大体他の場合の1/2位の濃度です。 ［山田］継代したあとの成長の悪い場合、それはinoculum sizeの大小によるのか、それとも細胞自体のgrowth rateの差なのか・・・。 ［勝田］初代から第２代に移すときはexplantsをかき落して入れるからinoculum sizeの問題ではないと思います。 ［伊藤］スライドの中に見られたAtypicalの細胞は実質細胞ではないのですか。 ［勝田］大部分は実質細胞と思いますが、他のものも若干混っているかも知れません。 ［佐藤］細胞の形態は自分のところで生えてくるのと同一の気がします。うちでは最初の４日間位迄はExp.とCont.は差がありません。 ［山田］いま見せてもらったデータの限りでは、Exp.群とControl群との間に差のあることは明白だと思います。その意味付けを考える必要があるでしょう。
《佐藤報告》１．発癌実験 前報に引続いて行った実験を記載し、後に本日迄の結果を纏めます。
◇Ｃ24(1962-7-6=0日)ラッテ生後28日
◇Ｃ25(1962-7-11)ラッテ生後33日 前記二つの実験は対照の結節発生率を０％として実験群の陽性率を高める積りでラッテの生後日数をのばしたが、対照は予定通り０％となったが、実験群も陽性率が低下した。従って現在私が行っている作用方式では呑竜ラッテで23〜27日間が差が最も現われ易い。 メチルDABに関して前報◇Ｃ21及び◇Ｃ22の観察をつづけた。ラッテは同腹生後25及び 26日である。 ◇21は其の後、第23日で対照 2/6、DAB４日 2/6、メチルDAB 4/6となった。 ◇22は其の後、第24日で対照 1/5、DAB４日 2/5、メチルDAB４日 3/5、８日 2/5、12日 2/5となった。但、◇21と◇22例はどういうものか細長、云わばfibroblastic cellの発育が旺盛であった。◇21と◇22のメチルDABの一部は継代されたが、細胞はDAB型と異り突起の多い箒星形に近い細胞が増殖している。現在の結果ではDABとメチルDABの間には増殖する細胞形態にかなりの差があるが、細胞増殖の差は著しくない。 ◇７’此は廻転培養を長期つづけた所謂静止型の肝細胞がDAB投与で変化するかを見たものです。1962-4-12＝０日、生後79日±１日を廻転培養し、第59日目にDABを４日間投与したが、其の後33日の観察に変化は認められなかった。 ラッテへの復元
継代の現状 現在◇８、◇９、◇10、◇17、◇20、◇23で続行中
［山田］メチルDABがin vivoではCholangiomaを作ること、これとDABとの差がin vitroで出ているのかも知れぬということ。これはDABの濃度などを、たとえば、上げたりするとあのような箒星形の細胞が出てくるかも知れない。この箒星形の細胞は生体染色が可能でMacrophageではないか、という気がします。 ［佐藤］DABのとかし方には問題があるように思います。CH3DABは今後はやめてEpithel cellを作るDABだけで追いたいと思います。それから肝臓内接種はどうでしょうね。 ［勝田］それは私も考えたことはあるのですが、うまく刺したところにとどまってくれているかどうか、ということと、抗体の問題がありますね。 ［伊藤］AH-130だとPortaderに入れるとHepatomaを作ります。 ［佐藤］静止形肝細胞（59日ラッテ）にDABを４日与えましたがnegativeに終りました。うちのデータが、勝田さんのところほど、対照との差がはっきり出ないのは、Ratのせいでしょうか。techniqueのせいでしょうか。それからDABを長く入れると悪いというのは・・・。 ［山田］やはりtoxic effectに働く可能性があるのでしょう。 ［佐藤］DABの破壊物が作用している場合（in vitro）とDABがintactで働いている場合 （in vivoのexp.）とでは相違があるのではないでしょうか。 ［伊藤］復元接種する場合、沢山の細胞を得るのに時間がかかって、そのため細胞の alterationの可能性がありますね。 ［勝田］だからintracranialの接種をしようという次第です。細胞がばかに少くて良いというので・・・。 ［山田］Ehrlichだと100ケでheterotransplantationが効きます。 ［堀川］一気に大量を入れた方が良いと思います。Selective mediaとして生体を使うのが良いでしょう。 ［勝田］脳内接種でそこにtumorができた場合、継代はどうしますかね。 ［山田］Carcinomaならば継代は可能です。TumorができたかどうかはHirnの場合はすぐ判ります。切ると色がちがうし、細胞が多いですから。ホースターのdataでは、シリアンハムスターの復元接種で1万個がcriterionになっています。 ［勝田］それから目下のところでは肝組織を切出して、explantで培養していますが、explantの中にDABが仲々入りにくいかも知れぬということを考えると、これは余りefficiencyの良いやり方ではないから、将来は細胞をばらして培養することも考えなくてはならぬでしょう。 ［山田］細胞によるConditioningの問題があって、増えるtubeは増え、駄目なのは駄目のような気がしますが。 ［堀川］動物の方のConditioning、たとえばＸ線やCortisoneによる前処置などを考えては・・・？ ［高岡］Ehrlichを100ケ入れて何日位で増えてくるのですか。 ［山田］多分１週間位でしょう。 ［堀川］ＬにDAB処理して100万個、Ehrlichの株JTC-11を10万個と夫々マウスにIPで入れたのですが、Ehrlichの方だけ20日〜30日で死にました。 ［山田］脳内接種というのは色々な意味で良い接種部位だという話です。 ［佐藤］Ehrlichは１ケではつかんのですよ。 ［山田］一般にLeukemia系統はうまく行きますね。 ［堀川］制癌剤として働き、また発癌剤として働くならDNAなどに働くのでしょうか。 ［山田］DABは蛋白とくっついて働くと云われていますが、大部分はそうであってもDNAの方にも働くかも知れませんね。 ［堀川］Ｌか何かを使って、DABの作用機構をしらべるべきだと思います。 ［勝田］それも勿論良いことだし、やらなくてはならないことですが、今の段階では何といっても完全に癌化させ、復元も陽性にさせて、それからゆっくり色々の解析に入れば良いと思うんです。とにかく癌化させることが第１でしょう。
《高木報告》１）発癌実験
前報に報告した通りですが、これを括めると次の如くなります。
考案： Ａ．Golden hamster肝実験群
Ｂ．Wistar-King ratの肝実験群
Ｃ．Golden hamster腎実験群 Exp.は2、4、6、7、8、9で、動物の日齢は生後８〜24日、Stilb.４〜９日の処理である。培地は２〜20％血清を添加したLT、結果は継代後６実験中４実験が有意であった。 考案：
２）免疫学的研究 Ａ．血球凝集試験
（１）予備試験
（２）予備実験 Ｂ．蛍光抗体法
免疫血清：抗HeLa、Chang liver、FL及びJTC-4家兎血清
細胞：HeLa、Chang liver、FL及びJTC-4細胞
方法：抗家兎γglobulin山羊血清(labeled)は使用前、径約１cm高さ10cm位のSephadexのカラムでpurifyし、次に先ず0.1g/mlserum、更に0.06g/mlserumのrat肝のaceton powderで吸収したものを用いた。
染色に際しては抗家兎γglobulin山羊血清(labeled)は６倍に、また免疫血清は３倍にPBSで稀釋して使用した。染色時間は１時間、洗滌は30分間行った。染色度はHeLa細胞に同抗血清をかけたものの前を(+)後を(+++)としてこれを基準にした。なお判定はこの染り方の差をとった。
結果：種属特異性があることが分った訳であるが、それと別にこのdataに関する限りHeLa細胞とFL細胞のつながりが比較的少いことが分る。なお広汎に実験を進める予定です。
［勝田］継代法、第２代は静置ですか。（腎のトリプシンとMagnetic stirrerのことを指す) ［高木］そうです。 ［勝田］ハムスター腎とStilb.の組合せは有望のように思われますね。 ［佐藤］培地に入れたDABを果して細胞がとり込んで使ったかどうか、培地中のDABを何かで発色させ、比色で測ってみる手はありませんか。 ［遠藤］さあ、知りません。 ［佐藤］復元が確実に行ってくれれば良いが、もし仲々行かんような場合のことを考えると、他の早道を探してみたら・・・。 ［伊藤］復元以外に何か良い方法があるかどうか。 ［堀川］やっぱりまず復元してみることが第１でしょうね。 ［山田］メチルコラントレンは胃に入れると、数日後にもうその胃に変化があるが、その機構は判らないし、DABを喰わせて解糖その他をしらべても、それはただ量的意味で癌細胞をつかまえているだけのことで、質的には生化学的につかまえてはいないですね。 ［佐藤］若いラッテの肝の培養にDABを加え、そうするとExp.もCont.も両方出てきますが、それを両方とも復元してみるのは意味があるんでしょうか。 ［勝田］それもやってみる手はありますが、両方とも生えるのではDABによって細胞の性質が変ったということにはならないですね。たとえ変っていたとしても掴まえにくいし・・・。 ［山田］今日色々話に出た内で、DABの溶かし方の問題がありますね。使うときにうすめるか、培地でうすめて保存しておくか。 ［勝田］うちのたった１回の経験ですが、使うときにうすめたのは生え方が悪かった・・・。 ［山田］それからRatのageのことで判ったのは、若いのを使うとExp.もCont.も両方とも生えてくるが、年とったのは両方生えない、ということですね。
《山田報告》マウス肝組織初代培養に対するＤＡＢの作用 培養法：高岡さんの記載による。（月報No.6203）細切肝組織を５〜10個、角チューブ内面におき、付着後培養液を１mlづつ加える。 培養液：Exp.＃１ 0.5％Lactalbumin hydrolyzate in Hanks＋20％Calf serum、Exp.＃２ TC199＋20％Calf serum、液替は週２回 DAB：100mg in 5ml of Tween20＋45ml of dw（２mg/ml）を保存液とし、使用の都度、培養液で稀釋し、最終濃度を１μg/mlとした。 判定：Ep cellの層状のoutgrowthの出現をもって(+)とした。成績はすべて初代培養による。 結果：８実験の中、マウスの日齢が３〜14日の５例中３例はExp.Cont.両方が＋で、19〜26日の３例は両方とも増殖しなかった。
［勝田］（増殖しないというところで）血清のlotを変えてやってみなかったの。 ［山田］変えてみる予定です。 ［高岡］牛血清にはよくむらがありますが、仔牛血清なら良い筈ですがねえ。 ［勝田］血清の非働化は、一旦やっても、そのあと保存したときは使う直前にまたやらなくてはいけないと云いますね。 ［山田］血清学的にはそうされていますが、私は全然非働化しないで使いました。 ［佐藤］DABが果して本当にとけたかどうか、その化学的な基準か何か、可溶、不溶を決めるものはありませんか。 ［遠藤］さあ、知りませんねえ。溶けるときはさっと溶けてしまうし・・・。肉眼的に見て決めるだけでしょう。 ［佐藤］溶けているかどうか、ということは非常に問題になると思いますが、溶かし方をみなさんどうやって居られますか。 ［山田］Tweenでといて、水を加えるともうそのとき結晶が出る・・・。 ［勝田］水？ そこは水ではなくてSalineを入れるように月報にかいた筈だが。 ［高木・高岡］Salineを加えると、そこでは結晶は出ない筈です。 ［勝田］うちでは前の月報にかいたように（血清20％＋ラクトアルブミン水解物0.4％＋ SalinrD）の培地を加えて冷蔵庫で保存しています。 ［佐藤・山田・高木］うちでは濃いまま保存し、使用の度にうすめています。 ［勝田］さっき報告した内の１例のように、そんなところの差が成績にひびいているのかも知れませんね。
《伊藤報告》§発癌 前回の報告に書きました如く、RollerTubeによる発癌実験では細胞増殖の判定に自信がありませんでしたので、その方は今回上京した際に、もう一度高岡さんのやって居られる実物を見せて戴いてから、改めて開始する事にして、それ迄は前回にも一寸書いておきましたラッテ肝のtrypsinizeで得た細胞の静置培養法の方に手をつけて居ます。ただ、今迄にやったRollerTube法でやったものをsubcultureしたものに一部colonyの発現をみましたので、これは続けて居ます。 静置培養の方は３度試みて、３度共相当数の細胞を得て居りますが、２回目と３回目のものとでは、いささか細胞の形態が異なりますので、発癌実験に使う一方、必要な細胞をconstantに得られる様な条件を設定し度いと考えて居ます。 此の方法では比較的簡単に早く多数の細胞が得られますので、早い時期に復元出来るのではないかと予想しています。但し、発癌の有無は、復元以前の瓶内の観察だけでは恐らく不可能ではないかと考えます。
６月中旬頃よりL・P1の具合が悪くなり（これはどうもLactalbuminのせいだったようです。又、伝研から分けて戴き、それが殖えるのを待って居たりなどして、其後実験が進まず、癌学会の申込み原稿にも差支える程で困りましたが、やっと実験が始められる様になりました。CM-Celluloseによる分劃を検討しています。
［高岡］発癌に使っているのは何日位のratですか。 ［伊藤］20日、28日位のratです。 ［山田］トリプシンの濃度は？ ［伊藤］0.25％です。初めの10分間に出るのは棄て、あと20分間位のをとります。血液成分は特に除く方法はとっていません。 ［山田］肝実質はトリプシンに弱いですからね。 ［勝田］うちでもexplantで発癌に成功したら、次はばらばらにしてやりたいと思っていますが、それははじめに目ざす細胞以外のものは除いてから使いたいと思っています。 ［高岡］ばらばらにした細胞は増えるのですか。 ［伊藤］どんどん増えます。ですから早くに復元してみたらどうでしょう。 ［勝田］あまり早く復元するとDABが残っていたからと云われる難点があります。Ratの種類は？ ［伊藤］呑竜ですが、あまりよく増えません。 ［佐藤］うちのはよく増えます。やっぱり呑竜ですが。 ［勝田］山田班員は培地にラクトアルブミン水解物は使ってみなかったのですか。 ［山田］初めにやってみたのですが、これはratのageが大きすぎて、生えなかったのです。
《堀川報告》１）発癌実験
Exp.3：前号のExp.3のその後の結果では(3)と(5)はＸ線doseが大きかったため、その後も分裂増殖は認められず。（おそらくこのものは駄目と思われる） Exp.4：Exp.3で使用したＸ線doseをすべて150γに落し、その他は同じ系で実験を開始した。今回はＸ線doseは強くない様で細胞の死滅は認められない。５日目のSubcultureするまではControlに比べてExp.区がactiveに増える傾向にあったが、Subculture後この差はなくなり、７日目の現在に至る。痛切に感じるのは、この段階でどの区の細胞がactiveに増えているかと云う決め手の無い事で、同じ実験区の内にもvariationがあり、よろこばされたり、がっがりさせられる事が多い。とにかく復元実験で勝負するのが一番早いと云う結論が得られる。 ２）培養細胞における喰食性(Cytosis)と形質転換の試み。 最近新しい言葉として用いられる様になった細胞の喰食性（Cytosis）ト云う言葉は広い意味でpinocytosisとphagocytosisを含んだものであってpinocytosis(Drink)、phagocytosis(Eat)ともに古くから各種細胞で明らかに認められてきた現象である。この細胞の喰食性を利用して培養下の正常細胞を腫瘍化させようとするのがこの仕事の目的である。しかしこの種の正常細胞を腫瘍化させるにあたって、現在の段階では最後の決定的なものとなる決めてを探すのに苦しい。
［勝田］Mouse spleenに2,000rかけたものをＬに入れた場合、Ｌが巨細胞になるそうですが、核の数は？ ［堀川］１つです。 ［勝田］Mouse spleenにレントゲンをかけたことにより、何か巨細胞にするようなものをSpleen cellが出すように変るという可能性もありますね。 ［堀川］問題は、癌化の場合も５％位としても、それをどう旨くつかまえて復元するか、ということですね。Spleen cellsをratに入れて抗血清を作り、それをspleen cellにかけて抗原抗体反応をみることもやりたい、と思っています。 ［山田］Spleen cellとＬとが混合培養になるという危険は防げますか。若いのを使うと箒星のようなので継代可能なのが残りますが・・・。 ［堀川］培地をかえるとき、よく洗ってやると数日でspleen cellはすっかり無くなります。 ［山田］リンパ球系のはなくなっても、箒星のようなのは残ると思いますが・・・。 ［勝田］その可能性はあり得るね。それから発癌で、DABをやっておいてあとからレントゲンを弱くかけるとどうだろう。 ［堀川］よほど低いdoseでやらないと、primary cultureのものはすぐやられてしまいます。 ［佐藤］増殖していない細胞だとレントゲン耐性があるのだから、細胞を冷やしておいて、レントゲンを弱くかけたらどうだろう。 ［堀川］やっぱり駄目です。 ［佐藤］レントゲン耐性の細胞を復元すると、つくでしょうか。 ［堀川］Ｌの場合にはつきません。レントゲン以外の耐性のものもつきません。 ［山田］うちで作ったレントゲン耐性のHeLaは継代しているうちに耐性がなくなってしまいました。 ［堀川］果して本当にγ耐性を獲得したのかどうか。 ［山田］九大癌研にいる遠藤のところで、４ニトロキノリンを入れると核内に封入体ができる、それが癌化とどういう関係にあるかは判っていないが、そのようなことが判っていると、培養で割に簡単にキャッチできるのではないでしょうか。生体との関係についても意味付けて行けると良いと思います。 ［堀川］NatureにPiggy back systemというのが出ていました。マロン酸は生体では呼吸阻害をするが、細胞内へは入らない。in vitroでポリスチレンその他を入れてやるとpinocytosisでポリスチレンが入り、あとにつづいてぞろぞろとマロン酸が入るというのです。高濃度では入るが低濃度では入らぬというのも、また、あるかも知れませんね。 ［山田］ハムスターのpauchに入れると、１万個で癌ならつくが、正常ではつかぬと云われていますね。(Foley)。 ［勝田］この段階で癌学会に出して良いかどうか考えて下さい。 ［山田］勝田氏のところのデータは、現象的にははっきり差が出ているから、出して良いと思います。これは株ではなく、初代でやった、というところにまた意義があると思います。
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