《勝田報告》

　Resting liver CellsにDABをかけて“Proliferation”を起させることを第１段の細胞変化を見つける“目やす”としたが、第２段の変化を見附ける“目やす”として、前回報告したように、細胞形態のAtypismを目標に、最近の仕事を展開してきた。まずスクリーニングの意味でRLD-1株を使い、これに嫌気状態あるいは薬剤を使って、変化をしらべた。容器は小角瓶を直立させて用い、この底に小カバーグラスを入れておいて、一定期日毎に染色して標本を作った。実験＃はCarcinogenesisのMorphological examinationという意味で(CM)と冠した。CM-1では流動パラフィンを培地の上にのせて嫌気的にしたのと、培地交新をしない群（CM-2）を作ったが、後者では核に若干の変化が認められた。培地を永い間交新しないでおくと細胞は大抵やられてしまうが、しばらくそのまま放置すると、小さなcolonyが出てきます。しかしこの細胞はmorphologicalにはきれいでした。#CM4では、第７日以後、核小体が小さく数がふえたように認められました。Rat liver extractは15日間の観察では、核にわずかにAtypieがおこっただけでした。CM-9では、古い培地のfactorの一つとして、乳酸を積極的に加えてみたのですが、変化なし。CM-10から彼の有名なサリドマイドを試用。はじめは0.1、1、10μg/mlと加えてみたが、何れに於ても巨核の細胞、くびれ、こぶのついた核、多核などが出現、DNA代謝に強い阻害が示唆された。巨核細胞はcolonyを作り、且、そのままでも分裂するらしく、分裂像を認めた。また４極分裂などの異常分裂もあり、悪性めいた形態を示してきた。一般にmetaphaseに於て、規則正しく染色体が二方に分かれず、その横に取残されるような染色体のあることが屡々認められた。短期使用濃度としては10μg/mlが適当と判定された。この頃、同一のRLD-1株でも瓶によって若干細胞の相違が想像されたので、瓶にNo.をつけて継代のとき瓶をまぜず、#1の瓶は→#1と、系統を夫々独立させて継代することにした。その結果、#5はサリドマイドにより変化をおこさず、#6の系は第２回目の実験のときは対照群まで巨核ができてしまった。サリドマイドのcontaminationとは考えにくい。#1の系も第２回はControlにもできた。他の細胞株について３例おこなったが何れも実験群にも巨核その他はできなかった。これらの結果により、初代培養でDABで増殖を誘導し、それにサリドマイドをかける実験と、もっと薄い濃度でDABを永くかける実験とをはじめている。

Ｂ）染色体分析について：

　発癌実験その他で染色体をよくしらべる必要が出るが、従来の押しつぶし法では永久標本が作りにくいことと、押しつぶす要領が仲々体得しにくいので、最近Spreading法とAir-drying法をいろいろ試みている。細胞の種類によって色々modificationが必要のようである。

1. )Spreadingの方はJTC-12株(monkey kidney)でやってみたが、遠沈回数をなるべく減らすように改良し、次の方式に到達した。
   1. )コルヒチン10-6乗Ｍ、18hrs.37℃、培地に加え、液をすてSaline２mlを加え、強くピペットを使って分裂中の細胞をSaline中におとす。この液を短試に移し、倍量の蒸留水を加え（ときには徐々に）37℃、15分間、低張処理をする。
      （一方、スライドグラスをアルコールに入れ、冷蔵庫において冷しておく。）低張処理液をCarnoy固定液５mlを入れた短試に、よく振りながらゆっくり点滴、30分間静置固定する。原suspension２mlはCarnoy５ml、２本に分注できる。これを1,000rpm５分間遠沈後、上清をすて、沈渣と液少量を残す。（軽く、homogeneousにしておく）。冷えたスライドグラスをピンセットで１枚とり出し、濾紙の上に45°以上に立ててアルコールを軽く切った後、３〜４cmの台に片方をのせる。
      この斜めのスライドの上に、上記のcell suspensionをピペットで２滴位たらし、すぐピンセットでつまんで、アルコールランプの火の上で遠火で乾かす。（アルコールに引火しないように）。
      乾いたらギムザで染色、検鏡に供する。バルサムでカバーグラスをかけてもよい。

   2. )pipettingでmetaphaseの落ちにくい細胞では、細胞全体を剥して以後は上記と同じ操作をする。
2. )Air-drying法： 　あらかじめ瓶乃至シャーレにカバーグラスを入れて培養し、コルヒチンを培地に10-6乗Ｍ約20時間37℃で作用させた後、培地をすてずにそのまま5〜10倍容の蒸留水を徐々にあるいは適当の速さで加え、10〜15分室温におく。このCoverglassをとり出し（或はそのまま液をすてて）Carnoyで固定（室温2〜20分）。次にoverglassを平面におき、室温（１時間〜５時間〜１日〜１週：かなりの自由の幅あり）あるいは37℃（15分〜２時間〜半日）で標本を乾燥させた後、Giemsaで染色し、バルサムでslideglassに封ずる。

   　Primary cultureでDABによる生え出しのときなどはこの方法でないととても捕らえられない。

　染色体標本の作り方は、同じ細胞でもそのときによって、例えば低張処理の長い方がよかったり、短い方がよかったり、仲々未だよく判らないfactorがあるらしい。

Ｃ）ラッテ腹水肝癌AH-13細胞の培養：

　目下のところでは古川君が培養の基礎的条件を検討していますが、基本培地として（仔牛血清20％＋ラクトアルブミン水解物0.4％＋Pyruvic acid 0.01％＋SalineD）の培地で７日間に約４倍の増殖を示します。近い内ラッテ正常肝とのParabiotic cultureを試みる予定です。

Ｄ）L・P ４亜株のアミノ酸消費の比較：

　当室でかねてＬ株より４種の無蛋白培地継代亜株を作っているが、その培地はL・P1：PVP＋Lh＋Ye＋SalineD、L・P2：Lh＋Ye＋SalineD、L・P3：DM-120、L・P4：Lh＋SalineDである。そこでこれらの細胞を夫々（DM-120）の培地に移し、２日後に培地交新。さらに３日間培養した培地をアミノ酸自動分析器にかけ、培地内の各アミノ酸の消費され方を比較してみた。またその消費量を細胞数で割って、1000万個当りの３日間の消費量も計算した。平均細胞数の計算法は次式によった。平均細胞数＝log-1乗（log a＋log b/2）　但しa＝第２日の細胞数、b＝第５日の細胞数。

　培養前の培地DM-120の分析は４回おこなった結果を平均した。この各分析値は夫々よく一致し、max.error７％であった。細胞を培養後の培地は２回宛分析し、この平均値を出した。これもmax.error７％であった。

1. )最も著明な相違が４亜株間で見られたのは、Arginineの消費であった。使用前の培地には0.461μM/ml入っているのが、L・P1では0.339、L・P3では0.318の減少（70以上）を示すのに対し、L・P2と特にL・P4ではその1/10以下の消費しか示さない。

2. )Arginineの減少に対応し、培地に与えてない新しいニンヒドリン陽性物質（おそらくはArg.より由来したアミノ酸)が出現した。これには２種あり、一つはグルタミン酸とプロリンとの中間に出現する（X1と仮称）が、Ｌ原株にのみ認められる。第二のはProlineの位置に重なって現われ（X2）、L・P1、L・P2、L・P3に認められる。L・P4ではX1もX2も共に認められない。但しL・P2のX2はProlineより少しずれて出るので、Prolineの定量が可能であり、L・P1及びL・P3のX2と果して全く同一かは疑問で、むしろX3として別にしてもよいと思われる。

3. )Threonineの消費について、Ｌ原株及びL・P2が高い消費を示し、L・P1及びL・P3は低く、L・P4は逆に＋になっている。

4. )LeucineはＬ原株及びL・P2が高い消費を示し、L・P1とL・P4は低く、L・P3は逆に＋である。

5. )L・P3はLysineが＋（他の株はすべて−）、Methionine、Isoleucine、Leucineも＋であるのが特徴である。

6. )L・P4は他亜株に比べ各アミノ酸とも消費が少ない。

　これらの分析結果から考え、L・P ４亜株の間では、アミノ酸消費において、単に量的の相違だけでなく、定性的、質的相違も存在していることが明らかであり、Mammalian cellsの変異の研究、とくに生化学的面からの分析に期待をもたせるものである。

　なおこれら４亜株細胞の細胞蛋白質の構成アミノ酸の組成についても系統的に分析を進めているところである。

Ｅ）白血病細胞の蛋白構成アミノ酸組成の分析：

　腹水型マウス白血病細胞の培養が、現在使われている色々の培地を使ってみても、うまく行かないところから、よほど変った細胞にちがいあるまいと、その蛋白のアミノ酸組成をしらべたところ、MethionineとCystineが非常に少いことが判った。そこで人間の白血病細胞も若干手に入れ、順次分析中であるが、やはりCystineが少いような結果を得ている。これについては、東大小児科と共同研究ということで今後材料を次々と送ってもらう予定であるが、何も治療を加えていない内の患者の細胞が欲しい点で仲々簡単に材料が手に入らない。蛋白のアミノ酸組成か変っているということは、そのreplicationの元である核酸の構造も他の細胞とは変っているということであり、核酸のBase組成の分析も目下準備中である。

：質疑応答：

［山田］染色体の染色にFeulgenを使うと、色素が過剰につかないでよいが、色がうすいので位相差顕微鏡で見なくてはなりません。GiemsaですとpH＝４にすると、原形質が赤くなり、核がきれいに染まります。

［奥村］低張処理のまま遠沈すると、細胞がこわれ易い。固定は段階的にして行くのが良いと思います。Primary cultureのときは培地を半分位捨て、1:1に蒸留水を加えて１〜２分おき、さらに蒸留水を加えて２〜３分おきます。固定は1/100、1/10、１と３段階にしています。これは醋酸アルコールでもよい。Air-dryingは37℃、10分が良いと思います。

［勝田］処理のしかた如何で染色体はいろいろな太さ、長さ、形になったりするが、idiogramを作るときなど、標準の形というものは、どのような作り方をしたものにおいているのですか。

［奥村］コルヒチン処理は短い方が良いです。数をかぞえるときは48時間位がよいが、形態を見るときは短い方が良い。長いと太く短くシャープでなくなるので、時間の短い方を基準にします。またコルヒチンの濃度が高いと、形全体が不鮮明になってしまう。しかし重なっているものは、処理時間が長いとばらばらになり易いので、長い方が数える目的には向いています。コルヒチン処理３〜５時間で元の培地に戻し、そのままover nightして、翌日またコルヒチンをかけるようにするとダンゴ型はないし、分裂細胞の頻度も同じように出ます。10-4乗Ｍで処理すると２時間でダンゴになってしまう。Air-dryingと押しつぶしを合せる方法も目下試みています。

　また顕微鏡で見ながら低張処理をして行くと、きわめて短時間で細胞がぱっとふくらむが、そのあとはしばらく目立つ変化はなく、さらに低張にして行くと、或時間たって急に破裂してしまいます。この時間は実に短い。

［勝田］Modal numberの頻度などをしらべる場合、これまでのやり方はどうも、きれいにかぞえられる細胞だけについてかぞえ、その中での％を出しているようですが、分裂細胞全体についての％でなくて良いのですか。

［奥村］Chromosomeの形の美しいのは、Ana-meta phaseだから数としては多くはない筈です。

［高岡］全分裂細胞数をかぞえ、きれいに見える分裂像の数をかぞえると、Air-drying法の標本では、約１％です。だから全体のごく一部分を見ていることになります。TD-40瓶には細胞が500〜600万位はありますが、分裂中のが仮にその３％とすると、15万ケ位はある筈なのに、押しつぶし法では瓶１本で60〜100ケ位かぞえればよい方ですから、率は非常に悪いことになりますね。

［奥村］押しつぶし法でもドライアイスを使って永久標本を作る方法がありますが、これは剥すとき細胞が両方に残るので、分裂細胞はさらに減ってしまいます。押しつぶし標本は温度差に弱いので、なるべく恒温で保存する方がよいのですが、検鏡のときどうしても温度が上ります。素人が数をかぞえるときは、2n,4n・・・と荒っぽく分ける方が無難ですね。そして何かマーカーになるような染色体をみつけて、それを追う方法がよいでしょう。

［黒木］サリドマイドがglutamineのanalogと云われましたが、株細胞とprimary cultureの細胞とでは、グルタミン要求がちがいますから、細胞によってサリドマイドの影響も異なっても良いわけですね。

［遠藤］アンモニアは測ってありますか。表には出ていませんが・・・。

［関口］培地のアンモニアを測っても、それは操作中に他からcontamiする可能性もあり、意味がないので出さなかったのです。

［堀川］Cellのlife cycle（mitotic cycle）を追ってアミノ酸消費のちがいを見たら面白いでしょう。

［勝田］それは予定しています。Synchronous cultureを使ってね。

［黒木］Eagleの培地は使えないのですか。

［勝田］あれは血清蛋白を少し入れなければ増殖しない培地で、駄目です。

［奥村］＋になるのはどういう風に考えたらよいのですか。

［関口］こういうのは、消費と合成の差引をみているわけで、合成の方が多ければ＋になるわけです。純合成だけとか純消費とかをみたいときはアイソトープを使う必要があります。

［堀川］亜株を原株の培地にしばらく戻してからアミノ酸要求をしらべてみたらどうですか。本質的なちがいを生じているのかどうか判るでしょう。

［黒木］山根さんがLactalbumin hydrolysateのビタミンを定量したら、Eagle培地の1/10位だそうです。unpublished dataですが。

［遠藤］私はfreeのアミノ酸分析を考えていますが・・・。

［関口］蛋白構成アミノ酸の分析には細胞が1000万個位は必要ですが、freeのアミノ酸プールをしらべるにはその10倍は少なくとも必要ですから、細胞の用意が大変ですよ。それからグルタミンは全部はグルタミン酸にならず、プロリンやアスパラギン酸などにもなりますので、glutamine要求をglutamic acidで完全にはおきかえられず、夫々別個の要求と考えた方がよいと思います。

［山田］Monkey kidneyのprimaryではglutamineからglutamic acidに行くという報告がありますね。

［遠藤］Glutamineは、味の素の再結晶したのは市販品よりpureです。

［黒木］Inoculum sizeで要求の異なることがありますね。

［山田］poolと培地中のアミノ酸との間に平衡関係がある筈だから、inoculum sizeによって異なる事はあり得ます。それから白血病ですが、マウス白血病細胞(AKR)を、folic acid(V-B12)などを培地に加えて培養し、generation timeが10時間位で毎日継代すると継代できるというのがあります。これは継代してもMalignancyは保持しています。

［黒木］このleukemiaはどの程度のmalignancyをもっていますか。

［高岡］腹腔に接種して４〜５日で大抵死にます。

［黒木］SM36の腹水型leukemiaも培養がむずかしくて、早く細胞が死んでしまいます。

［堀川］Leukemia cellのSH・compoundsが少いということはどういうことでしょう。

［関口］これからDNAのbase ratio、G-Cratioとアミノ酸との関係も追究して行けると思っています。

《佐藤報告》

　◇Ｃ36及び◇Ｃ37は前報に引きつづいてDAB短期投与、生後15日及び20日を用いて実験を繰りかえしました。但しDAB及び投入血清は１月17日新調した。◇Ｃ36は生後15日ラットを使い、結果はDAB添加１日群は4/5、２日群は3/5、３日群は2/5、４日群は1/5、対照群は2/7。◇Ｃ37は生後20日ラットで、DAB添加１日群は4/5、２日群、３日群、４日群は皆1/5、対照群は0/5でした。

：質疑応答：

［山田］DABは１〜5、6μgで血清中に入れるのが、protein-boundDABの形になって安定のようです。

［勝田］3'-methylDABで出てきた細胞は染色体数のばらつきから見て非常に有望だと思いますが、細胞の形態は？

［佐藤］ホーキ星状のとEpithelialのと共存しています。3'methylDABだと染色体数が42本より多くなり、DABだと37〜38本に行くような気がしますので、実験を進めています。後者は長期間DABを作用させると37〜38本のpeakがはっきりします。Rat心からの放血が不足だと肝培養によくないような気がします。

［奥村］Adult ratのliverでは4n、8nが多いことは事実だがageによる差は不明です。

［堀川］New bornの細胞はAdaptしやすい性質があるのではないでしょうか。

［佐藤］Chromosome numberは生体環境で支配されているような気がするので、in vitroの変化によって数の変ることはあり得るでしょう。Normalにも異常なものが含まれていて、それがin vitroに移されたとき、生え出すという風に考えてみたい。特に若いageのものがその率が高いのではないでしょうか。生後20日以後のは、2nが出やすいような気がします。

［奥村］In vitroに移す前にCarcinogenを与えておいて培養したらどうですか。Methyl-cholanthreneによる皮下腫瘍のデータでは染色体数の変化は先行しないという報告があります。肝の4nは早い時期にあらわれるような気がします。

［勝田］In vitroでcarcinogenを与えるのでなければ、変って行く経過が判らない。佐藤君、3'methylDABの実験をもっと何回もやって、夫々について染色体数のばらつき方を比較して見たらどうですか。

［佐藤］MethylDABとDABはattackする所が異なっているのでしょうかね。

［山田］培養日数が６ケ月位になると染色体数が3n辺りに移る可能性が大きいから、3'methylDABのlineのバラツキは必らずしもreagentの差に還元できないでしょう。

［勝田］最近の「自然」にBurnetの“Scientific American"に出た論文の和訳が出ていて、マウスの生後１日のものの胸腺をとり、あとから別のマウスの皮膚を植えると、それがつく、というのが出ていましたが、我々も復元法にこんなのも取入れてみたいと思っています。

［山田］手術でなくてもＸ線のbeamで胸腺をinactivateしたらどうでしょうか。

［佐藤］DABをVitaminBと一緒にやると、in vivoの発癌率は悪くなるようですね。

［黒木］DABとproteinの結合はin vivoで１週間で起りますが、それ以上にこのprotein-boundDABが蓄積されないと発癌しないようです。

［遠藤］DAB処理で生えてくるのは、DAB-resistant cellがselectされて生えてくるという可能性はありませんか。つまりin vivoの発癌とはちがっているのでは・・・。

［勝田］In vivoの発癌のときにも初期に我々のとそっくりな小型の細胞が増殖してくるので、我々のがちがっているとは考えにくいですね。むしろin vivoとそっくりで、前癌状態に入っているのだから、もう一息と思っています。

《杉　報告》（高木班員代理）

1. ）rat肝（DAB５例）主として星芒状の間質細胞様のものが生え、対照群との間に差がなく継代出来ず。

2. ）hamster肝（stilb.５例、DAB１例）培養10〜15日目頃に実質様細胞が生え始めたが対照との間にはっきりした差異を認めず。継代は不成功に終った。

3. ）hamster腎（stilb.10例）培養４日目から上皮様細胞又はこれと繊維芽様細胞とが一緒に生え始め、10例中３例の実験群で対照群に比ベ上皮様細胞が優勢を占めるものが多くあらわれ、２例の実験群で対照群より旺盛な発育を示した。又これらを継代すると、初代においては差がみられなかった実験例でも、実験群と対照群との間にはかなりの差があらわれた。

　hamsterに対する発癌剤の文献、どうも有難うございました。その中の2-Acetylaminofluoreneは私共が使っているstilb.に構造上稍似たところがあり、rat liverにもcarcinomaを作るといわれていますが、stilb.にはそういう働きはない様です。

：質疑応答：

［奥村］初代でEpithelialのがdominantのは、継代してもそのままですか。

［杉　］継代（トリプシン）するとfibroblasticのが減って、Epithelialのが多くなります。

［奥村］動物のageによって生え出してくる細胞がちがいます。若いとfibroblast様のが多いですね。

［勝田］それは一般に云われていることです。それよりstilboestrol→kidneyのとき性別の影響は？

［杉　］動物実験では♂にしかできないのです。

［勝田］stilboestrolの増殖に対する影響は見てありますか。

［杉　］大体のところは見てあります。100μgになるともう駄目です。

［奥村］２、３代継代して細胞の形が揃ったところで添加したらどうですか。

［勝田］実験群（Ｓ）の方が良いというのは、Epithelialが多いんですか。それとも全体の増殖が良いのですか。

［杉　］全体の増殖がよいということです。それから継代のし方ですが、初代10本なら第２代も10本という風にやっています。

［勝田］それは問題ですね。実験群と対照群と細胞密度、inoculum sizeがほぼ揃うようにして継代しないと、ものが云えないでしょう。

［杉　］これからの問題として、性の差を見たいと思っています。

［勝田］Exp.とControlに本当に差があるかどうか、これをまずはっきり確かめた上で、両者の比較分析に入るべきでしょう。変化したということを色々な面、復元接種とか染色体数とか色々な点ではっきり検討証明して欲しいですね。

［黒木］復元はcheek pauchに入れるのですか。

［杉　］まだやっていませんが、そのつもりで居ります。

《伊藤報告》

　吾々の班がin vitroでの発癌を試みて仕事を開始し、先ず勝田先生のところでラッテ肝のRoller Tubeによる培養にDABを与え、その増殖の仕方に於いて、実験群と対照群との間に差があると云う事実が認められ、それが突破口となって班員一同でその追試をやり、佐藤先生のところでも同様の結果が報告されて、其後此の方法で種々の面で展開をみて来た訳であります。小生も先ずこの方法の追試を試みましたが、テクニックのまずさの為か余りきれいな結果を得る事が出来ませんでした。

　それで誠に勝手ながら、此の方法での研究は勝田、佐藤先生にお願いするとして、小生は別に初から多量の細胞を得て出来るだけ早期に復元する事を目的として、肝細切→Trypsin処理の方法で培養可能な細胞を得る事を検討して来たのであります。

　此の方法によって、Originは分らないが、比較的揃った種類の細胞が得られ、而も増殖して、比較的早期に復元に必要なだけの細胞数を得られると云うことが分り、この方法によって数回復元を試みましたが、何れもnegativeの結果でした。ここで小生の採用している方法を反省してみますと、まずtecknicalな問題として、

1. )期待した程の細胞数を得る事が仲々困難である事。
2. )毎度皆様から指摘されている様に細胞のoriginが不明である事。其他、
3. )現在の常識として、in vitroの細胞が悪性化していると云う事と、transplantableであると云う事は必ずしも平行しない。即、transplantableになる為には悪性化の他に何等かの要因が必要である。従って吾々のテーマである“in vitroでの発癌”と云う仕事をすすめて行くに当って、終局は復元可能な細胞を作る事を狙うとしても、その過程で起る変化をcheckする努力も必要であると思われる。

   吾々はbiochemicalな面で此の点を追ってみたいと考えて居ますが、其のためには復元と云う事で考えていたより以上の多量の細胞が必要であり、今の方法ではどうもそれ程の細胞を得る事が困難に思われる。

：質疑応答：

［勝田］君のやり方だとcell countingができる筈ですから、本当に増殖しているのかどうか、ちゃんとcountingをやって、基礎的なgrowth curveをちゃんと見せて欲しいですね。かぞえるときは同時に核や核小体のmorphologyにもよく気をつけて見て下さい。

［奥村］トリプシン消化するとfibroblasticのがずい分出てきますね。自分たちはEDTAで大分沢山とれています。

［伊藤］トリプシンとEDTAを初めに比較したら、トリプシンの方がよかったのでトリプシンを使っているのです。

［勝田］Ratのageによってもdegestのされ方がずい分ちがいますね。うちでもcell suspensionを作って、Replicate cultureでDABを入れてみましたが、率は悪いが出来なくはありません。40本中２本に増殖細胞のものと思われる、染まり方が株細胞のに似た核が認められました。

《山田報告》

　Hayflickのhuman fetal lung細胞系（WI38）を維持しはじめてから２月近くなります。現在よく増えて、既に30ampulesほど凍結保存を行っております。はじめ１、２代よく増殖して難しい事はないと思ったのですが、そのあと１、２代どうしても増殖せず、degenerationが目立って困ったのですが、文献的に調べた結果、biotin欠如に気付き、これを添加した所、直ちに増殖しはじめ、現在３日培養で平均1.9倍、４日培養で2.7倍程度constantに増殖しております。細かく書きますと、Hayflickはその論文でEagleのmediumを使うように書いておりますが、これはScience1955の文献で、13種のアミノ酸と９種のビタミンが入っております。

Eagleはその後1959年にもScience誌上に哺乳動物細胞の培養液を発表しており、液かえせずに長く培養するためには、アミノ酸組成を上記のmediumの２倍以上、ビタミンも幾分多量に加えており、ただbiotinはnonessentialとして除いております。アメリカ人にとってEagle培地といえばDifcoで売出している1955年のものを意味したのでしょうが、僕たちにはより新しい方が身近かに思えて、つい1959年発表のものを使ったわけです。

この細胞株と同様にhuman fetal lungからとった繊維芽細胞株を、はじめTC199C(20)で初代培養し、以後Biotin添加Eagle(1959)で培養しておりますが、既に６代で、３〜４日でおよそ２倍になり順調に増殖しています。この場合もBiotinをふくまぬEagle(1959)で培養開始したものでは細胞が増殖できませんでした。その他、マウス、ハムスター新生仔からも繊維芽細胞の継代をつづけており、biotinの有無の影響をみておりますが、やはりbiotinがいるといえそうです。HeLa、Ｌ，KB、HEp#2などはbiotinを必要とせず、biotin要求性で２大別されそうに思えるのですが、培養細胞系の大部分は上皮系で、またすべてaneuploidであることと、他方はdiploidであるfibroblast系なこと、そのいづれに差異が起因するか検討する予定です。

：質疑応答：

［勝田］DABが保存している間にこわれて行かないかどうか、君の測定法でこんどしらべて下さい。

［山田］このHayflickのようなやり方で培養して、constantな増殖を示す細胞を使えば増殖はしていても使いよいのではありませんか。

［勝田］どういう点で細胞の変ったことをCheckしますか。めくらで復元するんですか。

［山田］形態をみたり、増殖をみたりということでは、どうでしょうか。常に細胞濃度が高い状態で培養するというのは生体に近いということで、２ｎが保たれているのではないでしょうか。

［堀川］２倍体の方がレントゲンに弱いのですか。

［山田］そうです。

［堀川］私のところではＸ線をかけて、それで生き残る細胞をとって行くと、１回照射毎に染色体数が４〜５本宛減って行って、40本になったのがＸ線耐性と云いたいのだから、山田班員のデータと合いません。

［勝田］本当に２倍体ということが原因かどうか・・・。

［山田］２倍体３種とHeLaと比べたら、はっきり差が出たのですが・・・。

［奥村］２倍体でない正常由来の細胞株を対照に使ったら良いのではありませんか。

《堀川報告》

1. 正常Ｌ細胞がH3-thymidine labeledマウスSpleen細胞を貪食した際、さらにはC14-DL-Leucine labeledマウスSpleen細胞を貪食した際、貪食後急速にSpleen細胞のH3-labeled-DNAはＬ細胞核内に、一方Spleen細胞のC14-labeled-proteinはＬ細胞の細胞質または核の周辺に吸収されてしまうことは前報で報じた。これらの結果は貪食されたSpleen細胞のDNAもproteinも分解されてＬ細胞自体の核酸、蛋白合成に使用されるものであろうと云う可能性を強く暗示している。しかしこの場合、貪食されたSpleen細胞のDNAがどのような形でＬ細胞核にincorporateされて行くかを決定することは、Ehrlich細胞核のDNAがＬ細胞のDNA合成にどのように使用されるかと云う問題と同様に興味ある問題点である。

   　H3やC14分析用のガスクロカウンターが回転出来るまでの予備実験として、P32を用いてEhrlich細胞、Spleen細胞、Ｌ細胞などのDNA、RNA、酸溶性分劃などへの取り込みを調べOptimum incubation timeを決定したが、これまで得られた結果は面白く、Ｌ細胞やEhrlich細胞はほとんどの細胞がDNAとactiveな酸溶性プールをもっているが、一方Spleen細胞中にはSmall lymphocyteのようにactiveな酸溶性プールを持たない、いいかえると分裂してふえて行く可能性のない細胞が混在しているということを強調するような結果を得た。これらはすべて予備実験で得た脇道の結果であるが、これらで得た結果をもとにして現在各DNABaseを適当なH3またはC14 labeledアナローグでラベルしてＬ細胞内でのその行動を追跡中である。

2. 一方マウス体内でのdiffusion chamberによるin vivo cultureは、これまでネンブタールによる一定の麻酔時間を選定するために、その濃度、injectionする場所などいろいろと調べて来たが、やっとStrainとしてはmouseのRFが良いということがわかり、現在は実際に細胞をChamber内に入れてmouseの腹の中にうえこみ、その増殖などを調べている段階である。いづれも下積実験というところでぼつぼつ報告出来るデータを出したいと思っています。

［勝田］Labeled nucleusを貪喰させたあと、その喰われた核の染色性はどうなって行きますか。

［堀川］染色性は落ちますが、うすく染まっています。

［勝田］こういうAnalogの類で癌をなおすということは無理です。生体内の正常細胞でも、たとえば胃壁の細胞なんかgeneration timeが非常に短いから、そっちもやられてしまいます。我々の現在の立場ではむしろ、こういうAnalogを培養に使って、細胞を混乱状態に持って行っておいて、そこへ発癌剤を作用させるという手があると思います。

［山田］BUDR自体では発癌作用はないのですか。

［堀川］ないと思います。

［勝田］染色体modeのpeakがなくなったというのは、BUDRをどの位使ったときですか。

［堀川］50μg/mlで３ケ月です。

［奥村］少くなるだけで多くなるのはありませんか。

［堀川］殆んどありません。

［佐藤］Peakのずれは、ずれるのか、それとも全然ないところに、ポコッと出来るのですか。

［堀川］もとのＬには44本というのは全くなくて、２回位Ｘ線をかけると少し出てきて、４回もかけると44本がpeakになってしまいます。DABの場合ですが、DABがDNAのあるbaseをattackしてmutantを作るという可能性も考えられます。Protein-boundによるfeed back control mechanismも考えられないことはありませんが、こっちの方がclear cutでしょう。

《奥村報告》

1. 細胞の凍結保存前後における染色体数の変化。
2. Primary cultureで種々のOrganの変化。
3. SV40（Hamsterで皮下腫瘍を作る、サルの雑ウィルス）のin vitroでのcell transformation。（fibroblast→Epithelial)に変えるという報告もある。

［堀川］それはtransformationではなくて、inductionではないですか。

［奥村］文献的にはtransformationという言葉を使っていますが・・・。実験はDNA・virusであるSV40をgreen monkey kidney cellのcultureにかけ、H3・TDRでmonkey kidney cellをラベルしておくと、H3-SV40 virusができるわけで、これでHamster tumorを作ろうという次第です。

［勝田］堀川君に一つ、Transformation、Transduction、Inductionの区別を教わっておきましょう。

［堀川］図示して・・TransformationというのはＡ細胞の例えばDNAをとって、Ｂ細胞に入れ、ＢをＡの性質に変えると云うようなやり方のときを云い、Transductionは例えばphageなどの仲介によってDNAが移されるもの。

InductionはたとえばAlkaline phosphataseの無い細胞Ａ’にβグリセロリン酸ソーダを与えてaseを持つように変える。つまり或性質がＡ’に加わってＡになる場合を云っています。

［奥村］細胞の凍結保存前後の染色体数の移動は凍結後にはバラツキの幅がせまくなりMitotic figureも少くなります。株細胞ではもとのmodeを回復するものと認められますが、primaryのはrangeが変るようです。

［山田］DiploidよりTetraploidの方が物理的刺戟に強いとHaushkaが云っていますね。

［黒木］凍結による変化は、普段でも変るrangeの中で変るという報告（佐々木研・井坂）もありますね。

［勝田］この仕事は早くデータを括めて発表した方がよいと思います。しかしSurvival rateがもとの細胞数の30％なんていうのでは、非常にselectionの可能性が大きくなるし、死ぬ細胞は何か考えてみる必要があります。

［奥村］Trypsin処理が細胞をいためるために％が低いと思いますので、Spinner cultureで細胞を生やすようにしてEinwandを減らしたいと思います。

次に第２の問題ですが、primary cultureで色々な動物の色々なorganの細胞を培養して行きますと、次第に2nが減って行きます。そして何日位経ったらDiploidが50％以下になってしまうか、その日数を仮にFD50と名付けてしらべてみますと、Human Embryoでは、Lungは135、Liverは17、Hamster（new born）では、Lungは29、Liverは8、Kidneyは108、Brainは16、Monkey（adult）ではLungは66、Kidneyは108、Testisは42、Rabbitでは、Kidneyは28、Testisは37になりました。つまりSpeciesやOrganに関係がなく夫々ばらばらの結果を示しています。Testisは1nをとる目的で培養したのですが、1n±1は2/100ありました。なおこのdiploidというのは2n±3をそのrangeに入れています。

Subcultureの基準はcell sheetが底面の70〜80％できたところで、１本→２本にしました。培地は（CS20％＋M・199）です。

［勝田］Diploidの本数が多くても少くても全部2n±3というのは少しおかしいですね。

［山田］FD50の長いのはfibroblastで、短いのはEpithelialとは云えませんか。

［奥村］云えません。

［勝田］この仕事には夫々の各代の増殖曲線をとって、全分裂回数との関係を出してみる必要があると思います。つまり、分裂をよくすると早く2nから外れ易くないかどうか、そういう点もcheckしておく必要があるでしょう。

《遠藤報告》

まだ完全に終ってはいませんが、その後の実験を含めて、大略をまとめてみます。（増殖曲線と表を提示）

　BS20％：10μg/ml以下の濃度域におけるステロイドホルモンのHeLa株細胞の増殖に対する影響は、それぞれのホルモンの生物学的活性に何らかの関連を持つらしい。☆代謝終末産物のEstriol、中間体dehydroisoandrosteron、或はandrogenic activityの弱い合成anabolic steroidsは10μg/mlでも増殖に影響しないのに対し、biologically active natural steroidは10μg/mlですべて抑制効果を示し、更に低濃度でそれぞれ何らかの影響を示す。

　BS2％：上記の通り、それぞれのステロイドの生物学的活性と密接に関連すると考えられた特に低濃度での効果が、培養条件を変えると逆転する場合がある。

　以上の結果から、細胞レベルでホルモンの影響を検討しその生理的意味を評価する場合、基礎的実験条件の吟味が特に重要であることがわかる。

：質疑応答：

［勝田］BS２％のExp.は細胞のそのときの生きのよさをcheckするため、BS20％も同時に第２Controlとして加える方が良いでしょう。前代、実験に使う前の培養日数は揃っていますか。

［遠藤］ひどくはなれてはいませんが、一定はしていません。

［勝田］濃度を一定にしておいて、Inoculum sizeを変えてみることもやりたいですね。

［佐藤］Control群の増殖の悪いときは、inoculum sizeが少なかったという可能性もあります。

［奥村］Hormoneによる促進のmechanismはどう考えますか。それから、血清とhormoneの関係ですが、血清中にも含まれているので、血清のロットが変ればgrowthも変ると思います。

［遠藤］Sponge matrix cultureをいまやっていますが、これによって、

1. massive culture、
2. Redifferentiation、
3. Interaction

SpongeはPolyvinyl-alcohol sponge（tumorを作るといわれていますが）と、Polyurethan sponge（人造血管に使われています）を使っています。細胞はprimaryのchick embryo fibroblast、JTC-4、Ｌ，HeLaです。Urethanの方ではJTC-4しか増えません。Cellular interactionについては、三角コルベンに、spongeに細胞を吸わせて入れます。spongeを色々な形に切っておいて、細胞の種類を区別します。培養後spongeをとりだし、細胞をしぼり出してcountingをするわけです。

［山田］Seedingのとき細胞が落ちませんか。またspongeといっても真中のところはnecrosisになり易く、量的な扱いは困難と思いますが・・・。