【勝田班月報：７００３：抗原抗体反応による細胞膜の変化】《勝田報告》
：質疑応答：［佐藤］班長の所で自然発癌が１例出来てくれて、ヤレヤレ大安心ですよ。これで私の所の自然発癌がウィルスのためだと言われなくてすむでしょう。［勝田］まだまだ・・・。岡山のウィルスの疑いは消えていませんよ。・・笑・・ ［佐藤］私の所のデータでも4NQOを数多く処理すると細胞質に空胞や脂肪胞が多くなって、動物への復元成績が悪くなるようです。 ［勝田］4NQO１回処理の場合、処理後培養を継続すると、処理された時変異した細胞がポピュレーションとして増えるのではないかと思います。それが何度も処理をくり返すと、その増え始めている変異細胞集団を叩いてしまう結果になるのではないでしょうか。 ［佐藤］4NQOとDABとでは癌化の過程が大変違っているようですね。4NQOは１度処理しただけでもその後、悪性が進行するようですが、DABは変異した状態が割に安定していて、再処理によってその悪性度がcumulativeに増えてゆくのではないでしょうか。 ［勝田］動物実験でも4NQOは１回の接種で癌を作ることが出来るが、DABは長期間与えなければなりませんね。ということはDAB発癌では発癌剤が或る程度、細胞内に蓄積されることが必要なのでしょうか。 ［吉田］4NQOは直接にDNAに影響を与えますから、放射線に似た作用を持つと言えますね。アゾ色素にはそういう作用はないとされていますから、培養細胞に対する作用の違いは理に適っているようですね。 ［山田］4NQO処理の追い打ちをかけた場合、復元成績からみると確かに動物の生存日数は長くなっていて、その点からみると悪性度は増していないように見えます。しかし接種した細胞の全部が悪性化しているのではない場合、３カ月とか４カ月とかの長期間かかって死んでいることから考えて、あまりはっきりした判定は下せないのではないでしょうか。少なくとも、細胞電気泳動のデータからみると集団としては悪性度の強いものが4NQO処理を重ねることによって増えてきます。 ［勝田］4NQO処理によって少数の変異細胞が出来、徐々に変化がすすむので、動物にtakeされるようになるのか、又は少数の悪性化した細胞が出来、それが集団として増殖して動物にtakeされるようになるのか・・・。これはこれからの問題ですね。4NQO処理後の初期に軟寒天で変異細胞を拾うとか、細胞電気泳動で泳動値の異なるものを拾うとか方法を考えなくてはなりませんね。それから高木班員の宿題にしたと思いますが、悪性化した細胞に正常細胞を混ぜて復元すると、どういう結果になるか知りたいですね。 ［高木］その実験は試みたのですが、実は正常細胞として混ぜたものが、自然発癌していたことが判って、全く無意味なことになってしまいました。・・笑・・ ［佐藤］DAB処理の実験の場合は経時的にコロニーを拾って復元しておけば、うまくゆけばtakeされるコロニーとtakeされないコロニーとをはっきりさせられると思います。しかし4NQO処理では処理後早いうちにコロニーを拾ったとしても、クローンの増殖を待つ間に悪性化が進んでしまうから駄目ですね。 ［山田］4NQOの毒性をうんと減らして、セレクションの可能性を低くする事を考えてみたらどうでしょう。 ［勝田］マルチフォーカスかモノフォーカスかということを確かめる方法を考えてみたいですね。 ［吉田］なるべく短期間に変異し、また変異までの期間も大体一定という系がほしいですね。しかし期間は一定にならないようですね。 ［勝田］変異細胞の出現までの期間が、まちまちだということは変異説にとって有力なデータですね。それからかなり難しいことだとは思いますが、発癌剤の爪アトを見つけることも大切なことだと思います。 ［佐藤］DAB発癌の実験で自然発癌の細胞とDABで発癌した細胞との間に、DABの消費について量的に違いがあるようです。動物にDABを与えて出来た肝癌もそうですが、組織培養で長期間DABを添加して出来た肝癌はDABを消費しなくなります。自然発癌の系はDABを消費します。 ［吉田］それは癌と関係があるかどうか判りませんよ。耐性の問題かも知れません。 ［勝田］それもこれからの問題ですね。
《山田報告》前回報告しましたごとく、抗原抗体反応によって惹起される細胞膜の表面の変化を、カルシウムイオン細胞表面吸着性の増減により検索しています。すなわちその基礎実験としてラット腹水肝癌AH62Fをドンリューラットに1,000万個I.P.に移植し、18日目に大動脈より採血、この血清中に産生されてゐる同種移植抗体を抗原細胞(AH62F)に種々の条件で反応させ、その細胞膜の変化をカルシウムを含むメヂウム内での電気泳動度の測定により検索してゐます。その二、三の成績は既に前報に書きましたが、改めて測定の標準誤差を附した表を示します。 この実験を含めて、以後すべての実験の対照としてaliquotの血清を温度処理したものを用いてゐます。即ち56℃30分温度処理により血清中に含まれる補体を非働化したものを対照としたわけです。補体はすべて正常ラット血清を０℃で３回AH62Fを加へて自然抗体を吸着した後のものを使用しています。結果はメヂウム内にカルシウムを加へると細胞膜の変化がより明確に検索出来ます。 Antiserumによって細胞表面へのカルシウム吸着性が増加します。 今回は更にpilotの実験を幾つか行いました。その成績を報告します。
：質疑応答：［難波］酵素処理で細胞はばらばらになりませんか。又死ぬ細胞はありませんか。［山田］ばらばらになったり、死んだりする細胞はありません。それからシアリダーゼ処理で荷電がおちるということが、シアル酸の減少と、ダイレクトに言えるかどうか判りませんね。 ［難波］細胞膜だけを分離して泳動度をみるとか、核だけにして泳動度をみるとかは出来ませんか。 ［山田］膜の分離というのは複雑な操作が必要で、むつかしいですね。裸核のデータは持ってはいますが、裸核にするまでの操作が泳動度に大変影響します。 ［藤井］同種抗体の影響は抗体の濃度を変えると、どうなりますか。 ［山田］まだ、詳しいデータは持っていません。 ［藤井］RLH-5・P3の抗血清はどうやって作りましたか。 ［高岡］RLH-5・P3はJAR-1から出来た系なので、JAR-2の腹腔内へ1,000万個/rat生きたままで接種しました。
［藤井］CulbはJAR-2にもついてしまいます。ウィスター系ならすぐ抗体が出来るのですが、同じJAR-1から出来た系でもなぎさ変異の細胞は抗原性が違うようですね。
［山田］トリパン青による生死判別でのデータよりはずっと感度が高いです。 ［藤井］RLH-5・P3の出来た系−JAR-1のラッテ肝で吸収するのがよいでしょう。 ［吉田］マウスではH2抗原で系特異抗原がずい分調べられていますが、ラッテについてはあまりデータがありませんね。この方法で調べられませんか。 ［山田］間接的には調べられると思います。
《難波報告》N-15：4NQOによるラット胎児培養細胞の癌化に、4NQOの処理回数が重要なのか、培養日数が必要なのかを検討これまで、私共のところでのラット培養細胞を4NQOで癌化させる実験では、細胞を10-6乗Ｍ4NQOで頻回に処理しなければ発癌しなかった。即ち、未株化全胎児、肺細胞の場合は最低20回、株化した肝細胞を使用した場合は最低５回の処理をしなければ細胞は癌化しなかった。 今回は、全胎児培養細胞(RE-7)を使用して、細胞の癌化に4NQOの処理回数が効いたのか、処理はそれほど必要でなく培養日数を重ねることの方が重要であったのか、の２点を検討したので報告する。（図を呈示）9、12、15、20回4NQO処理当時の復元では造腫瘍性のなかった細胞を、更に培養を続け培養216〜226日目にそれぞれの細胞を復元した。なお、この系では4NQO処理24回培養165日のものを復元すると、進行性の増殖を示す可移植性の腫瘤の形成が認められている。 結果は9回、12回処理のものは造腫瘍性がなく、15回のものでは３匹中１匹に復元後2カ月後に接種部位の皮下に母指頭大の腫瘤の形成があるが、現在6カ月後腫瘍は退縮の傾向を示している。20回処理のものでは1/2に動物は腫瘍死した。以上のことから結論されることは、私共の発癌実験系では細胞の癌化に4NQOの処理回数が効いていることが判る。培養細胞の癌化の機構を考える場合、発癌剤を頻回に処理したのでは、その機構を解析する際複雑になるので、今後は発癌剤の処理回数を少くするよう努力したいと考えている。 更に、以上の現象を、4NQO処理回数を増し、細胞が癌化に近づくにつれ、変異集落の出現がどの様になるかを検討した。（表を呈示）結論されることは
の２点である。 では、はたして変異集落は造腫瘍性を有する細胞よりなるかどうかが問題になる。そこで変異集落の腫瘍性の有無を検討した。4NQO処理24回の培養細胞より５コの変異集落をクローニングして動物に復元した。復元に使用した動物は、生後２日目の新生仔ラットを使用し、各集落細胞の悪性度を比較するために、C-3以外は同腹のラットを使用した。その成績（表を呈示）から結論されることは
以上のことから、間葉性由来と思われる細胞を使用して、発癌実験を行う場合、変異集落の出現破砕棒の癌化の指標になると考えられる。
：質疑応答：［吉田］クロンの復元についてですが、もとの培養が悪性化したことが判ってからコロニーを拾ったのですか。それとも悪性化以前に拾ったのですか。［難波］悪性化していることが判ってからです。 ［勝田］軟寒天で拾ったのですか。 ［難波］液体培地です。カップ法で拾いました。 ［山田］細胞集塊の実験についてですが、細胞集塊の出来ることをどう考えますか。 ［佐藤］どうして出来るのかは判りません。実験的にみて胎児の細胞は旋回培養で細胞集塊を作ります。成ラッテの肝細胞では細胞集塊は出来ません。そして悪性化したラッテの肝細胞も細胞集塊を作ります。悪性化ということが未分化とつながるのかとも考えています。細胞集塊を作らせ、その組織像をみることによって、悪性化の過程を追えるかと考えて始めた仕事です。 それから、胎児から出発したデータと、あとの肝細胞のクロンから出発したデータを混同しないで理解して頂きたい。クロンは株になったものから拾っています。もっと若い培養からクロンを拾いたいと努力していますが、難しいですね。 ［勝田］4NQO処理のあとの形態異常は必ずしも発癌剤のせいと言えないのではないでしょうか。増殖障害に伴うごく一般的な所見のようです。 ［高岡］クロン化してからの染色体数のバラツキが大きすぎるように思いますが、１コの細胞から出発しても結局あんなにバラツイてしまうのは何故でしょうか。 ［佐藤］細胞自体のせいか、培地のせいか判りませんね。例えばエールリッヒの株などは、少数細胞をまいて100％コロニーが出来ます。そしてそれぞれ染色体数の違う、又きれいなピークを持ったクロンがとれるのです。それから継代法によっても細胞の性質の安定度が変わりますね。
《安藤報告》4NQOによるL・P3細胞DNAの“二重鎖切断”の再結合について。昨年来報告して来たようにL・P3、RLH-5・P3のDNAの4NQOによる二重鎖切断は回復培養によって再結合される。一方、堀川班員によるとEhrlich、Ｌいずれを使っても再結合はされないという。そこで現在この点の矛盾を解くべく実験を行っているが、先ず今回はL・P3細胞での結果の再確認実験の結果を述べる。 （図を呈示）4NQO 10-5乗Ｍ、30分処理直後にはDNAはトップから1/3に来ているが、回復培養24時間後には再びボトム近く迄移動し、大きなDNAに再結合している事がわかる。なおこの再結合の程度は少しずつ実験によって異るが、再結合が起る事は確実である。但しこの再結合が厳密な意味でDNAのデオキシリボース、リン酸結合の再結合であるか否かについては目下検討中である。
：質疑応答：［勝田］4NQO処理によるDNAの切れ方は、何時も同じ大きさに切れますか。［安藤］何回か同じ実験をくり返しましたが、大体一定の分子量に切れるようです。 ［勝田］同じ方法で何回もくり返すだけでなく、別の方法も使って確かに何時も同じ大きさに切れるのかどうか、確かめてほしいですね。 ［吉田］4NQOはDNAを切っているのでしょうか。それともリンカーのような物を取り除いているのでしょうか。あんなに、きれいにピークを作るという事は、でたらめでない切れ方をしているのでしょうね。4NQOの濃度を変えると切れる大きさは違ってきますか。 ［安藤］違ってきます。 ［佐藤］4NQOの濃度を上げると切れ方が小さくなる訳ですね。そこは判りますが、次に回復出来なくなる限度があるなずですね。この実験法でそこが判ると、悪性化の一番効率のよい濃度を知る事が出来るのではないでしょうか。 ［吉田］DNAが出来るだけ小さく切断されて、しかも修復の出来る可能性もあるという濃度ですね。 ［安藤］しらべてみる必要がありますね。 ［吉田］処理後、24時間の分析は、細胞の一部がこわれ一部は増殖しているという状態のものについて、調べているのではありませんか。 ［安藤］顕微鏡で調べたところでは、こわれた細胞は見当たりませんでしたが。 ［佐藤］DNAに4NQOが結合したような形の場合、4NQOはDNAの修復の障害にはならないものと考えますか。 ［安藤］DNAの修復そのものには障害にならないかも知れませんか、それが次々とサイクルをまわるにつれて変異の原因になるかも知れません。 ［吉田］4NQO処理によって切断されたDNAの二重鎖が、24時間培養すると再結合してもとの大きさ近くになるということは判りましたが、もう１サイクル分位追ってみないと、その先細胞がどうなるかということは判りませんね。 ［勝田］それから堀川班員とのデータの違いを解明するには、L・P3を血清培地で培養して、4NQO処理をしてみれば良いのではありませんか。
《高木報告》
：質疑応答：［梅田］器官培養用の組織は、どういう方法で薄切りにしていますか。［高木］マイクロチョッパーという道具を使っています。 ［勝田］チョッピングの場合の培養法は・・・。 ［高木］普通の器官培養と同じように培養しています。 ［勝田］圧をかけるにはどうしていますか。 ［高木］三春製作所に特別に作らせました。高圧滅菌器のような構造のものを使っています。 ［藤井］高圧がよいのは、組織片の中まで培地や気層が滲みこむためですか。 ［高木］そうでしょうね。 ［難波］温度の低い法がよいのは、代謝が低くなるからでしょうか。 ［高木］そうだろうと思っています。インシュリン産生が低温の場合どうなのか調べてみたいと思っています。
《梅田報告》目下培養中の長期継代例をまとめて累積増殖カーブを画いて比較したので、それについて述べる。
：質疑応答：［安藤］ペニシリックアシドとはどういうものですか。［梅田］ペニシリンの分解産物といったものと関係があるもののようです。 ［高岡］株化したものの染色体数はわかっていますか。 ［梅田］染色体やダブリングタイムについて、これからしらべる予定です。
《藤井報告》Mixed hemadsorption法によるCulb-TCとRLC-10細胞の抗原差の検定；吸収抗血清による反応。前回の月報で、WKAラットにCulb細胞を接種して得た同種抗血清でmixed hemadsorptionをおこなって、Culb-TC細胞がその変異前の株であるRLC-10より有意に強い反応を示したことを報告した。 今回は、ラット抗Culb血清(WKA)を、Culb腫瘍細胞の由来したJAR-1系ラットの肝細胞で吸収し、吸収後なおCulb細胞に反応する抗体が残っているかどうかをしらべた。 抗血清の吸収：WKAラット抗Culb血清(Fr16A)、0.3mlにあらかじめ冷しておいた(氷水中)洗滌ラット肝細胞(packed cells)0.15mlを加え、０℃、60分間、ときどき揺りながら反応させ、その後遠心して(2,500rpm、30分間)得た上清を吸収血清とした。 Mixed hemadsorption(Exp.012870)：抗血清が少いのでマイクロ法を用いた。microdisposo-trayに１日培養したCulb-TCとRLC-10について、前号に記した方法でmixed hemadsorption(MHA)をおこなった。 （表を呈示）成績は、Culb-TC細胞を標的細胞とする成績は、抗血清を正常ラット肝で吸収しても、吸収前の抗血清とほぼ同程度のMHA反応を示している。一方、RLC-10細胞を標的細胞とすると、抗血清、1/3、1/9稀釋のいづれにおいてもMHA反応の低下がみられた。すなわち、ラット抗Culb抗体(群)には、正常ラット肝組織では吸収されない抗Culb抗体のふくまれていることが示唆される。 RLC-10細胞に対する反応が、抗血清の吸収後にもなお残っていることには、次の２つの理由が考えられる。１つは、すでに勝田教授から報告があったように、この株はspontaneous transformationをきたしており、正常ラット肝組織で吸収されにくい抗原をもっているかもしれないこと。もう一つの説明は吸収が、上記の０℃、60分館では不充分であり、特に反応後の遠心が2,500rpm、30分間であることは、溶解細胞片が除去できていない可能性がつよい。（写真を呈示）吸収血清でのMHAでは、indicator red cellsが標的細胞の無いガラス面に附着していることが多く、反応の読みを妨げる、これは抗体を結合した溶解細胞片がガラス面や細胞に附着しその上にMHA-反応がおこった可能性がつよい。 以上の成績や、同種抗Culb血清で示唆された抗Culb-TC、RLC-10細胞の反応の強弱、異種抗Culb血清で示唆された抗Culb抗体の存在などは、未だなお決定的ではないが、in vitro chemically induced malignanciesの抗原を示すものである。 今回の実験で、抗Culb血清のCulb細胞による吸収も試みたが、用いたCulb細胞は凍結保存していたもので、吸収操作後も細胞溶解が強く抗原を除くことが不充分であったので、除外した。同種抗血清の量が少く、吸収後の超遠心ができなかったが、この点の検討と、同種抗血清をＩ125あるいはＩ131で標識し、そのCulb-TC、RLC-10による吸収実験と追加交叉吸収実験を準備しています。
：質疑応答：［勝田］血清を沃度のアイソトープで標識して使う場合、フリーの沃度を洗い落とすことなど、よく気をつけてください。［藤井］はい。とにかく＋−でなく数字でデータを出したいのです。 ［勝田］細胞についた赤血球を集めて溶血させて数値に出来ませんか。 ［藤井］そういう方法を使っている人もあります。 ［高木］吸収する時、細胞はこわさなくてもよいのですか。 ［藤井］今みているのは細胞表面の抗原をみているので、細胞をこわすと、又違うものが出てくると思います。 ［難波］トリプシナイズしても、又変わってくるでしょうね。 ［高木］吸収は０℃でする方がよいのですか。 ［藤井］血清を非働化していないので、補体が働かないようにと考えて０℃で反応させています。 ［難波］吸収にラッテの胎児の肝細胞を使ってみたらどうでしょうか。 ［藤井］吸収についても色々考えていますが、何しろ抗体値の高い血清を作ることが先ず必要で、それが又なかなか難しいのです。CulbはJAR-2系のラッテでは抗体値の高い血清が出来ないようです。
《三宅報告》前の班会議でのべたT10というd.d.系マウスのEmbryonic cellのtransformしたと考えられる系について継代９代及び11代目のクロモゾームの分布をしらべた。（図を呈示）Modeの１つは60に、１つは64にあった。Karyo typeの分析を施行中である。なおこの細胞の増殖曲線をみると、（図を呈示）７日間で約48倍となり、前にAuto radio graphyで求めたtg=23hという数字とよく一致することを知った。またこの細胞のCell suspensionを作り、Sponge matrix cultureを行い、その間葉性の組織学的性格を知りたいと思ったが、Spongeの中心間隙にしみこんだ細胞は変性し、この試みの第一は失敗に帰した。
：質疑応答：［難波］スポンジの大きさはどの位ですか。［三宅］5ミリ〜7ミリ位の角です。 ［藤井］培地は何を使われましたか。 ［三宅］こうし血清＋Eagle MEMです。 ［高木］tumorはスポンヂの中へはいって行ったのですか。 ［三宅］それは、はっきりわかりません。始めに押し込んだ分かも知れません。 ［高木］suspensionの場合のやり方は・・・。 ［三宅］なるべく濃いcell suspensionをスポンヂェルにしみ込ませて培養しました。 ［梅田］培養の初期にはスポンヂの中に生きている細胞が居たわけですね。 ［三宅］そうだろうと思いますが、途中経過を追っていないのでわかりません。 ［難波］繊維は銀染色だけでみて居られるようですが、もっと他の例えばワンギーソンとかマロリーを染めてみるとよいと思います。
《安村報告》☆ラット肝細胞の初代培養からのクローン化の試み:In vitroのchemical carcinogenesisの研究のこれまでの実績(みなさまの)にわたしなりになにかcontributeしようと思って始めたのが初代培養からのクローン化の仕事です。できるだけ実験条件をsimpleに、variablesを最少限にする出発点は細胞の側からいえばpure cloneでありましょう。この仕事は井上幹茂君がまだ医科研癌細胞研究部におられたときに始めたものです。 “思いは高く暮らしは貧し”のたとえの如く、これまで得られた結果はかんばしくありません。cloneがとれそうでいま一歩のところで足ぶみ状態というところです。ここでは経過報告ということになります。 (1969-8-4) 7月29日生れの(つまり生後6日めの)JAR-2(F11)の♂♀１ぴきづつの肝が出発材料です。肝を細切して、PBSで洗ってから2,000u/mlモチダトリプシリンを加え、10分、37℃におき、mediumを加え遠沈、上清をすて、沈渣にスプラーゼを１ml加え、遠沈、mediumを加えてメッシュを通してから、３たびmediumで洗い、細胞浮遊液をつくった。細胞浮遊液をしばらく(2〜5分)放置し、上清部分を♂、♀由来のものそれぞれパストゥールピペットで一滴ずつプラスチックシャーレ(径50mm)にまいた。(♂由来４枚、♀由来４枚）、もう１群は細胞浮遊液0.5ml/plateのものを♂由来４枚、♀由来４枚作った。mediumはEagle MEM＋CS 10％。 (1969-8-16) 12日めになって♂由来の細胞浮遊液１滴の群の１枚のシャーレに径約0.5mmのEpithelialのコロニーが１コ発見された(シャーレをくまなくしらべたがこの１コ以外に細胞コロニーはみつからなかった）。 ♀由来の同群のシャーレ１枚に２コのコロニーがみつかった。１コはEpithelialで他の１コはfibroblast-likeであった。これらのコロニーをステンレススチールのカップで拾いあげ、♂由来のものから４枚のシャーレにまき、♀由来のものから３枚のシャーレにまかれた。 (1969-9-6) その後３週たって♂由来の４枚のシャーレのうち１枚−かりにE1系とした−から５コのepithelialの細胞コロニーが発見された。 ♀由来のものではEpithelial colony(かりにE2とした)からは３コのepithelial colonysが出現し、fibroblast-likeのものからは１コのコロニーもできなかった。(図を呈示） そこでそれぞれのコロニーを再び拾いあげ、E1-1コロニーからE1-4までそれぞれ４枚のシャーレにまかれた。E2-1、E2-2はコロニーが小さすぎたので１本ずつの短試にいれ、0.5mlのmediumを加えて培養した。E1-5コロニーも小さいので１枚のシャーレへ、E2-3は３枚のシャーレにまかれた。 (1969-9-27) その後３週めにE1-2のシャーレ１枚より４コのコロニーをpick upし、再び別々のシャーレにまかれた。 E1-2-1、E1-2-2、E1-2-3、E1-2-4と假の名を与えてそれぞれ２枚ずつのシャーレが作られた。 (1969-10-4) その後１週それぞれのシャーレでの細胞の増殖がよく、E1-2-1の１枚のシャーレから短試に移されHepro-1、E1-2-2の１枚のシャーレから短試に移されHepro-2、と名付けられた。E1-2-3の１枚のシャーレから５コのコロニーが拾われHepro-3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、べつの１枚のシャーレから２コのコロニーが拾われHepro-3-6、3-7、と名付けられた。E1-2-4の１枚のシャーレからは２コのコロニーが拾われHepro-4-1、4-2と命名された。（図を呈示） そのごは原因ははっきりしないが増殖が止って今日に至っている。
：質疑応答：［勝田］３代目のものを一部試験管に移しておいたらどうですか。［安村］たいていシャーレにまく時、同時に一部分試験管に入れておくのですが、試験管の方は増殖してくれませんでした。 ［佐藤］私も初期の培養の肝細胞からクローンを拾おうと何回かやってみましたが、なかなかうまくゆきませんね。１コだけ釣ると増え出しません。又コロニーが出来ても何故かトリプシンではがれなくなります。 ［安村］細胞が何故かうすくなってしまいますね。
《吉田報告》（概略）バラバラにした染色体を、異種の培養細胞に取り込ませ、そこで遺伝因子としての機能を発現させ得るかどうか試みている。材料としてはハイブリッドを作る系としてよく使われているチミヂンカイネースを持たないマウスの細胞へ人由来の染色体を取り込ませようとしているが、なかなか染色体を取り込んでくれない。いろいろ実験して今までに判ったことは、染色体にプロタミンをまぶしてやると細胞へ取り込まれる効率がぐっとよくなり、又細胞内で消化されにくい。
：質疑応答：［安藤］フリーなDNAでは変異を起こせませんか。［吉田］この種の実験に始に手をつけた癌センターの関口君はDNAでも変異が起こると言っていますが、私としては矢張り丸ごとの染色体の形のままで取り込ませたいのです。 ［安藤］細胞融合の場合は一緒になった染色体の片方だけが消化されてしまうということは少ないのに、染色体レベルで取り込ませると、取り込まれた染色体がすぐ消化されてしまうのは何故でしょうか。 ［吉田］染色体をバラバラにすると、どうしても染色体がダメージを受けます。そのために取り込まれてすぐ消化されてしまうのだろうと思います。染色体まで持ってゆかずに裸核の状態で取り込ませてみようと考えています。染色体にヒストンをまぶして取り込ませることも計画しています。 ［安村］取り込む方の条件と取り込まれる側の条件とがインタクトだと共存するが、取り込まれる方が壊れていると異物として消化してしまうということですね。 ［安藤］核として分離すれば、インタクトだという考え方でしょうが、核が分離されたとき、すでにDNAが分離されているというデータもありますよ。 ［吉田］でも染色体だけにするより、ましでしょう。又取り込まれた染色体が消化されてしまわないようにライソゾームを持たない動物の細胞を培養して使ってみることも考えています。
《堀川報告》培養哺乳動物細胞のDNA障害と修復機構(19)前報では温度処理した細胞を用いることにより、細胞内に取り込まれた4-HAQOがどうも第一義的にDNA鎖の切断に関与しているというだめ押し的な結果を報告したが、これに続いてでは45℃で30分間温度処理された細胞(つまり生存能を失った細胞)を4-HAQOで処理してDNAを切断させ、その切断されたDNAが再結合し得るかどうかを知ることは非常に興味があることである。 こういった目的から今回は温度処理した細胞を1x10-4乗Ｍ 4-HAQOで30分間処理することにより、Single strand breaksを誘起させ、これがincubationと共に再結合するかどうかを検討してみた。(Double strand breaksは私共の実験では再結合しないことがわかっているのでこれはあえて実験に使用しなかった。) 今回は学年末で何やかやと時間を雑務にとられ、図表をおみせ出来ないが、前述の温度処理後4-HAQOによって誘起されたsingle strand breksは4-HAQO処理しただけの対照区と殆ど同様に再結合することがわかった。ではこの温度処理をすることによって細胞内のactivityがどの様に変っているかを調べるため、細胞にH3-leucine、H3-Uridine、H3-Thymidineを取りこませ経時的に細胞を取出し、蛋白、RNA、DNAへの取り込みを調べた結果、温度処理(45℃、30分間)した細胞でも処理後少くとも24時間以内は正常細胞に比較して非常に低い活性ではあるが、これらの分劃への前駆体の取り込みのあることが分かった。 つまり以上の結果をひっくり返して考察すると、4-HAQOによって誘起されたsingle strand breaksの再結合のためには、その細胞は将来死すべき運命にあろうとどうであろうと、そこで既に内存する僅かのenzyme活性によって再結合は起り得るものであることを強く示唆しているように思われる。勿論こうした細胞内の分子的機構はたんに4-HAQOで誘起されたsingle strand breaksの再結合の場合にのみ考慮すべき現象ではなくて、莫大なＸ線の致死総量を照射して生じるsingle strand breaksの再結合の際にも当然あてはめて考えねばならない現象であることは言うまでもあるまい。次回には図表入りで詳しく説明したいと思います。 |
