【勝田班月報：７６０６：ヌードマウスの生理的背景】《勝田報告》
：質疑応答：［翠川］脂質を溶かす為にはアルコールを使ったのでしょうが、その影響はどうですか。［高岡］対照群の１つにアルコールのみの添加群がありますが、使用した濃度では全く増殖に影響ありません。 ［乾 ］ある一つの脂肪酸の働きだと考えていますか。 ［高岡］次にそれぞれの脂肪酸を一つづつ添加してみるつもりです。 ［高木］超音波処理のコーン油とアルコールで溶かしたコーン油で違いがありますか。 ［高岡］超音波処理したコーン油はみてありませんが、コーン油を使ったのは検討をつける為で、次はきれいな脂肪酸を一つ一つ加えて結果を出さないと、毒性助長の機構は判らないだろうと思っています。 ［梅田］解毒の方はalbuminによる変性として判りやすいのですが、毒性促進の方は脂肪酸とどういう相互作用を考えていますか。 ［高岡］スペルミンと脂肪酸が物として反応して毒性が増すというより、細胞膜に対するスペルミンの影響に脂肪酸が何か関与しているのではないかと考えています。 ［山田］昔、スペルミンの細胞膜に対する影響を電気泳動法で調べ始めたことがあったのですが、スペルミンと肝癌毒性物質の関係がはっきりしなかったので中止していました。又やってみましょう。
《難波報告》30：ヒトとマウスの正常2倍体細胞の4NQOに対する反応性の差違化学発癌剤による癌化が非常に困難な正常ヒト2倍体細胞と、癌化しやすいマウスの細胞とを4NQOで処理した場合、どこに一番大きな差が出るか検討した。 その結果は(表を呈示)、クロモゾームの変化の項にのみ両細胞間に著しい差のあることが判った。マウスの細胞では、3.3x10-6乗Ｍ 4NQO 1hr処理、24hr後の染色体標本で30〜68％の細胞に異常がみられるのに対して、ヒトの場合は(表を呈示)10％前後の異常しか見い出されない。マウスの細胞はもともと培養によってクロモゾームが変化しやすい傾向があり、それに4NQOの効果が重なって著しい染色体の変化をおもすのかも知れない。 ヒトの細胞は培養条件で染色体は非常に安定でそれにAging現象と重なってヒト細胞の培養内癌化を困難にしているのかも知れない。 31：ヒトの染色体をなるだけ変化させるものは何か (30)の項に述べたように染色体の変化を強くおこすものほどヒトの細胞の癌化を起す可能性がある。ヒト末梢血リンパ球を培養し、種々の方法で処理し、染色体の変化を調べた。(表を呈示)現在までの結論はレントゲン線のみが有意な染色体の変化を起す事が分る。
：質疑応答：［吉田］このデータでは4NQO処理群の染色体異常がとても少ないですね。普通、染色体異常をおこすポジティブな対照として4NQOを使っている位ですがね。［難波］私も意外でした。 ［乾 ］リンパ球が他の細胞とは大変違うのかも知れません。 ［翠川］リンパ球を使った理由は何ですか。 ［難波］ヒトからの材料としては簡単に採れるからです。 ［梅田］リンパ球は分劃して使っていますか。 ［難波］赤血球を沈殿させ、血漿部分の全白血球の培養ですが、分葉核などは早いうちに死んでしまいます。 ［乾 ］AF-2は佐々木、殿村のデータでは染色体異常が出ていますね。 ［難波］私の実験では濃度が薄かったのか、出ませんでした。 ［乾 ］ヒトの細胞は仲々染色体異常を起こさないのは何故でしょうか。 ［難波］ヒトの進化はもう極まっているとか。そういう事でしょうかね。
《梅田報告》今回の組織培養学会研究会で発表したfilter culture法で先々月迄の報告に加わった新しい知見についてのみ記載する。さらに発癌性芳香族炭化水素による培養内発癌実験の際知っておきたい使用細胞のarylhydrocarbon hydroxylase(AHH)活性の簡便な測定法について報告する。
：質疑応答：［遠藤］6TG耐性の細胞をHAT培地で培養するとどうなりますか。8AG耐性細胞の中には膜の透過性が無いために生存できるという形のものがあります。［乾 ］8AG→HATで生残るコロニーを梅田さんの場合はどう考えますか。 ［梅田］リバータントとは考えていません。真の耐性を拾っていないと考えています。 ［難波］技法としてですが、200万個の植え込みは多すぎませんか。死んだ細胞の酵素が濾紙に残って作用することはありませんか。 ［梅田］細胞数は確かに多すぎたと思います。しかし死んだ細胞については濾紙法では洗い流されるので軟寒天法より優れていると思います。 ［山田］膜の透過性についてですが、細胞を殺さずに透過性を高める方法はありますか。 ［遠藤］ある種のポリエンなど加えれば高められるでしょう。 ［山田］以前そのことで苦労しました。透過性が増すと細胞死が多くなるのです。 ［吉田］耐性の問題は単に生死の判定では無くて、遺伝的にどうかという事を調べるべきですね。染色体構成をよく調べてそのレベルで安定したものを使い、その変化と耐性とを結びつけて確認すれば、耐性になったり又消失したりはしないでしょう。 ［勝田］ヒトの細胞で安定した系がほしいものですね。
《高木報告》
：質疑応答：［乾 ］経胎盤的に薬剤を投与した場合、24時間生きていれば使える筈ですよ。［高木］産ませたいのです。 ［勝田］ヒト膵培養を何とか長期間維持するためにホルモン添加など試したら・・・。 ［高木］一時的にインスリンの産生を抑えたらどうかと考えて、培地中にインスリンを添加してみましたが、効果はありませんでした。 ［吉田］分裂機能を高めるか・・・。 ［遠藤］分化の方を止めることを考えるのですね。 ［勝田］もう一息という感じになってきましたね。 ［高岡］x3MEMはどんな培地ですか。 ［高木］アミノ酸とビタミンが3倍で、但しグルタミンは１倍です。それに核酸とZnSO4とが加えてあります。
《乾報告》AF-2投与によるハムスター胎児細胞の癌化 過去数回にわたりAF-2による染色体切断、突然変異、同物質経胎盤投与によるハムスター胎児細胞の形態転換を報告した。本号で、ハムスター線維芽細胞にAF-2を直接投与して、細胞の培養内癌化を観察したので報告する。 実験方法と材料：実験には妊娠12〜13日のハムスター胎児由来の線維芽細胞、培養2代目を使用した。培養条件は、Dulbecco's MEM＋20％FCSの培地を使用し、5％炭酸ガス添加空気中で細胞を培養した。3種のニトロフラン(化合物の図を呈示)の他にBenz[a]pyreneを使用した。化合物は培地中で1x10-5乗〜1x10-6乗 6、24時間投与した。 実験結果：AF-2投与後の細胞の累積増殖曲線の一部を図に示す。 対照のDMSO投与細胞は、投与後50日前後で増殖を停止した。 AF-2、5x10-6乗Ｍ投与群は、投与後30数日で形態転換し、10日以内の細胞をハムスターに移植した所、ハムスターチークパウチに腫瘤を形成した。ニトロ・メチルフラン、ニトロ・フリルチアゾール投与細胞も１例をのぞいて、増殖能を獲得したが、形態転換は起こさなかった。Bp投与群の一例投与後、80日で形態転換を示した。(図を呈示)AF-2投与細胞群のAF-2投与後の増殖曲線を示した。対照の6例は１例をのぞいて投与後30〜50日で増殖能を失った。AF-2 1x10-6乗Ｍ投与群の細胞も同様の結果を示した。AF-2 5x10-6乗Ｍ、1x10-5乗Ｍ投与細胞11例中6例は増殖を継続し、投与後60日以内に内3例が形態転換し、その内1例が悪性転換し、ハムスターチークパウチに腫瘤を形成した。 (表を呈示)形態変換した細胞の生物学的特性を記す。対照のDMSO投与細胞に比してコロニー形成率は著しく増大した。Population doubling timeは短縮し、対照のそれに比して1/2になった。Saturation densityは5〜10倍に上った。AF-2投与群の5x10-6乗Ｍ投与群の１例(AF564)の細胞を10万個ハムスターに投与した所、ハムスターに腫瘤を形成した。他の2例は、移植後腫瘤形成はみられなかった。ハムスターに腫瘤を形成したAF564細胞は軟寒天中でコロニーを形成した。(表を呈示)5,000〜10,000個シャーレに播種後形成したコロニーの形態転換率は、短期実験でも5x10-6乗Ｍ以上投与群で形態転換コロニーの出現率が増加した。
：質疑応答：［翠川］AF-2の場合、多量、長期間添加すれば変異率が高くなるとは言えないのですね。 ［乾 ］一つには死ぬ細胞が多くなって変異率が下がります。 ［翠川］ハムスターを使った理由は何故ですか。 ［乾 ］ハムスターは染色体についてのデータが沢山ありますし、染色体レベルの変異をみやすい利点があります。マウスはウィルスの問題が引っ掛かりますし、ラッテは変異しにくいようです。それにハムスターにはチークポーチという便利なものがあります。 ［吉田］しかしゴールデンハムスターはもう古いですよ。チャイニーズハムスターの方が染色体分析の上から有利です。 ［乾 ］チャイニーズでの発癌実験は報告例が少ないです。それに飼育が難しい。 ［吉田］雄が逃げ込む場所を作ってやれば、今では飼育もそう難しくありません。 ［乾 ］染色体だけでいうなら、ムンチャクの方が良いでしょう。《山田報告》
：質疑応答：［久米川］グルカゴンは処理後、何時間で電顕写真を撮られましたか。［山田］グルカゴンはシグマ製で、1.3mg/dl、24時間処理しました。
《久米川報告》酵素を用いないで分散した胎児肝臓のmono layer culture妊娠14〜19日に至る各年齡のマウス胎児肝臓をハサミを用いてできる限り細切した後、培養液を加え軽くポンピングし、メッシュをとおして組織片を除去した。細胞浮遊液に培養液(DM-153＋10％Calf serum)を適当に加え、シャーレに分注、炭酸ガスフランキで培養した。1/5程度の培養液を2〜3日毎に追加し、培養した。 培養2〜3日間はほとんど赤血球から成っているように見えるが、赤血球の死滅後、2種類の細胞が観察される。 その１つは紡錘形の細胞で、シャーレに付着する(線維芽細胞様)。他の１つの細胞は赤血球より少し大きく、形は円形で浮遊している。培養とともに円形の細胞は紡錘形の細胞の上に集まり付着する。さらに培養を続けると、ときにはあたかもorgan cultureした肝臓と同様の構造が見られる。 付着した円形細胞は、ポンピングのみでは剥離することはできないので両細胞を一緒にホモジネートし、2〜3の酵素活性を調べた。(表を呈示)organ cultureしたものに比べ活性値は低いが、培養20日後でも、それぞれの酵素活性は維持されていた。 胎児の年齢によって特に差は認められなかった。円形をした細胞が肝細胞だろうと考えられるが、今後酵素組織化学(G-6-Pase)および蛍光抗体法(albumin)によって細胞の同定または円形細胞の分離、継代を試みてみたい。
：質疑応答：［加藤］培養前のマウス胎児肝の酵素活性とも比較してほしいですね。［吉田］それから再生肝のような未分化な細胞の活性とも比べるといいでしょう。 ［翠川］肝細胞の機能の同定にビリルビンのことを余りみていませんね。胆汁を作るかどうかも調べればよいと思うのですが。 ［乾 ］肝にはステム細胞のようなものがありますか。 ［翠川］あります。
《関口報告》人癌細胞の培養 1.胃癌細胞株の樹立わが国では、胃癌の発生頻度の高いことを反映して、胃癌の培養も多く試みられ、私が調べた範囲でも9細胞株の樹立の報告があるが、多くは現存せず、また細胞の同定の不充分なものもあって、確かに胃癌由来であると考えられる培養細胞株は極めて少ない。 私は各種人癌の培養を試みているが、胃癌由来と同定しえた１細胞株を樹立した。 患者病歴：55才の男子、昭和41年5月、胃体部の鶏卵大の癌に対し胃全摘手術を川崎市立川崎病院で受けた。組織像はSignet ring cell carcinomaであった。昭和49年3月医科研付属病院に入院。鎖骨上窩に転移を認めた。左胸腔に胸水貯留。4月死亡。 培養法：昭和49年4月10日胸水中に浮遊する細胞を遠沈し集めて培養を開始した。培養液は40％RPMI1640＋40％MEMに20％FCSまたはヒト臍帯血清を加え、あるいは25％RPMI1640＋25％MEMに50％自家胸水を加えたものを用いた。容器は径45mmのガラス・シャーレを用いた。１つのシャーレに約100万個の細胞を植込み、炭酸ガス培養器内で培養を開始した。 培養経過：10日目頃よりガラス面に付着した細胞の上に球状の浮遊細胞が増殖し始めた。12日目に浮遊細胞を集めて初めてsubcultureを行ない、以後6〜10日おきにsubcultureを行なった。FCSを用いた培養細胞KATO-Iは6カ月目にcontaminationにより全滅。自家胸水を用いた培養は2カ月で増殖低下し消滅。臍帯血清を用いた培養細胞KATO-IIは良好な増殖を続けており、現在2年1カ月、78代になる。KATO-IIの11代より血清をFCSに変えて維持した細胞KATO-IIIは、IIを上廻る増殖を示し、現在90代に至っている(図を呈示)。 生物学的性状：KATO-II、29代のgrowth curveより計算したdoubling timeは77時間、KATO-III、60代のdoubling timeは36時間であった。染色体数のモードは89にあり34％を占める。異種移植による細胞の同定では、ATS処理ハムスターに1,000万個移植した場合腫瘤を形成したが、その組織像は原発巣とよく類似したsignet ring cell carcinomaであった。
：質疑応答：［勝田］これらの株細胞は何に使うつもりですか。［関口］私の研究室での主な仕事としての癌免疫の実験に使う予定です。 ［翠川］RPMI1640を使ったのには何か理由がありますか。 ［関口］人癌培養によく使われていたので使いました。私の場合はRPMI1640 50％＋MEM 50％で使っています。 ［遠藤］この例以外にも復元が成功した胃癌細胞株がありますか。 ［関口］大分調べてみましたが、どうも私のが初めてのようです。 ［山田］培養の成功率はどの位ですか。 ［関口］例が多くないのではっきりはしませんが、腹水からの成功率が高いようです。
《榊原報告》ヌードマウスの生理的背景について：医科研実験動物施設でspecific pathogen freeのもとに飼育されたヌードマウス(BALB/C-nu/nu)と、conventionalな条件下に飼育された対照(BALB/C-nu/t)各10匹ずつにつき、体重、臓器重量、末梢血球数、血液像、血清総蛋白量、血清蛋白分劃比をしらべ、全臓器の病理形態学的検索を行なった。動物のAgeは8週令、性は雄である。(表を呈示)先ず対照に比し、体重が少ない。だが各臓器の体重比をとってみると殆ど差はない。ただ、胸腺を完全に欠如していることは解剖で確認できた。血清総蛋白量は対照と有意差はないが、その内訳には顕著な差が認められる。即ち総じてglobulin量が少くalbumin量が多い。とくにγ-globulinは、対照の8.3％に対し、3.5％と著しく低値である。白血球数及び赤血球数が著明に少い。とくにリンパ球数は血液像から算出すると対照の5752/立方mmに対して2517/立方mmと半数以下の値である。病理形態学的所見としては、脾の白脾髄中心の動脈周囲及びリンパ節の傍皮質領域のlymphoid cell depletionが目立った。5月の月報に報告した通り、ATS投与ハムスターでは血清globulin分劃の増加、とくにγ-glob.値が著明に上昇している。この点を除けば−勿論thymusの有無という大きな違いはあるが−検索した範囲内でヌードマウスとATS投与ハムスターとは対照からの偏りに共通性が認められる。一見相反する結果とみられるγ-globulin値についても、Tcellが、Bcellに対してhelper actionとsuppressor actionという相反する作用をもつことを考慮に入れるなら、必ずしも矛盾するデータとは思えない。ヌードマウスに関して、現在その意義が不明とされている点は幾つかあるが、とくにathymicであるにも拘わらずB抗原陽性のリンパ球が常に数％存在していること、免疫監視機構の不全があるにも拘わらず、自然発癌率が対照マウスと同一であること、胸腺液性因子が内分泌器官の発育を左右していると云われるにも拘わらず、内分泌機構は全く正常であること等々が挙げられている。 |
